Как получить выписку из егрн бесплатно: Можно ли заказать выписку из ЕГРН Росреестра бесплатно

Содержание

Как получить онлайн выписку из ЕГРН бесплатно

В интернете встречается множество предложений выдать бесплатную выписку из Единого Государственного Росреестра Недвижимости. Рассмотрим этот вопрос подробнее, на самом ли деле есть способы заказать и получить данный документ бесплатно?

Всем известно, что для проведения любых операций с недвижимостью, необходим официальный правоустанавливающий документ на объект сделки. При продаже или покупке квартиры, строения или земельного участка, документом, подтверждающим законность владения объектом недвижимости, является выписка из ЕГРН.

В ней содержится полная информация об интересующем объекте недвижимости о предыдущих и настоящих владельцах, сведения об арестах, залогах и других обременениях, что гарантирует юридическую чистоту сделки. Эта сведения являются открытыми и общедоступными для любого гражданина РФ.

Правовые основания выдачи выписки

В соответствии с законами РФ, выписка из ЕГРН (ЕГРП до 01.01.2017) является официальным документом, обязательным для проведения сделок с недвижимостью.

В электронном виде с ЭЦП, или в бумажном виде с синей печатью, она имеет одинаковую юридическую силу для подтверждения права владения недвижимостью.

Выдача документов из Росреестра регулируется Федеральным законом «О государственной регистрации недвижимости» №218-ФЗ от 13 июля 2015 года, и приказом №968 Министерства экономического развития России от 23 декабря 2015 года.

Способы получения сведений из Росреестра

Есть несколько способов получить документ на недвижимость:

  • Обратиться непосредственно в подразделение Росреестра в вашем городе, или посетить их официальный сайт;
  • Подать заявку через МФЦ;
  • Оформить заказ в онлайн-сервисах через интернет.

Чтобы обратиться в Росреестр или МФЦ, необходимо непосредственно посетить их подразделения в вашем городе или сделать запрос нужной информации через интернет. На портале Госуслуги выписка из ЕГРН относится к неэлектронным, поэтому заказать ее через интернт не получится. По факту, портал госуслуг содержит только описание предоставляемых росреестром услуг, но не дает возможности совершить онлайн заказ.

На основании законодательных актов, для получения любых документов из государственных органов, нужно оплатить госпошлину. Размер оплаты будет зависеть от запрашиваемого документа, но заплатить будет нужно в любом случае.

Кто может бесплатно получить выписку

На основании приказа от №291 «Об установлении размеров платы за предоставление сведений, содержащихся в Едином Государственном Реестре Недвижимости» от 10 мая 2016 года, юридические лица могут получить бесплатно некоторые виды выписок.

Но в этот перечень не входят основные выписки, необходимые для проведения сделок с недвижимостью. Бесплатно доступны сведения о признании правообладателя недееспособным и только при запросе ее юридическими лицами.

Бесплатная информация

Бесплатными данными из ЕГРН, которые могут получить и юридические и физические лица, являются некоторые общедоступные сведения. Это даты регистрации и постановки на учет, номера и технические данные объектов, а также их кадастровая стоимость.

На сайте regrn.su справку о кадастровой стоимости и другие данные можно заказать значительно быстрее и удобнее. Узнать нужные сведения можно через поисковую форму по кадастровому номеру или по адресу объекта.

Граждане могут заказать выписку о кадастровой стоимости объекта недвижимости не выходя из дома

Выписку из Единого государственного реестра недвижимости (ЕГРН) о кадастровой стоимости объекта недвижимости можно получить в электронном виде в режиме онлайн с помощью сайта Федеральной кадастровой палаты (http://kadastr.ru/), не выходя из дома. Для этого на сайте нужно найти вкладку «Электронные услуги и сервисы» и выбрать «Получение сведений из ЕГРН». Затем, следуя подсказкам системы, заполнить необходимый запрос установленной формы. После подачи запроса заявители могут самостоятельно отследить статус рассмотрения своего обращения с помощью сервиса «Проверка состояния запроса online».

Выписка из ЕГРН о кадастровой стоимости объекта недвижимости в электронном виде предоставляется по запросам любых заинтересованных лиц в течение трех рабочих дней со дня получения органом регистрации прав запроса от заявителя.

Выписка из ЕГРН о кадастровой стоимости объекта недвижимости предоставляется бесплатно. На основании одного запроса в виде выписки из ЕГРН предоставляются сведения об одном объекте недвижимости.

Обращаем внимание, что сведения из ЕГРН в виде выписки из ЕГРН о кадастровой стоимости объекта недвижимости выдаются заявителю, если указанный в запросе объект недвижимости поставлен на государственный кадастровый учет. Если сведения об объекте недвижимости отсутствуют в ЕГРН, то заявителю выдается уведомление об отсутствии запрашиваемых сведений. В этом случае заинтересованное лицо может обратиться в орган регистрации прав с заявлением о постановке на государственный кадастровый учет, либо с заявлением о внесении сведений о ранее учтенном объекте недвижимости, приложив необходимые документы.

Согласно статистике, электронный вид запроса о предоставлении сведений из ЕГРН о кадастровой стоимости объекта недвижимости значительно превышает бумажный. Так, с января по сентябрь 2017 года в филиал ФГБУ «ФКП Росреестра» по Республике Коми поступило около 40 000 запросов из ЕГРН о кадастровой стоимости объектов недвижимости, причем более 67% из них — в электронном виде.  

Часто задаваемые вопросы / Мои документы

В зависмости от необходимых Вам сведений,из ЕГРН Вы можете заказать разные выписки.
Для получения кадастровых сведений и сведениях о зарегистрированных правах на объект Вы можете запросить выписку из ЕГРН об основных характеристиках и зарегистрированных правах на объект недвижимости. Данная выписка подтверждает постановку или снятие с учета объекта недвижимости, регистрацию вещного права на объект недвижимости. Если Вам нужна более полная информация по описанию местоположения объекта недвижимости и по описанию его частей, необходимо заказать выписку об объекте недвижимости.

Обе эти выписки предоставляются по запросу любых лиц за плату, размер которой устанавливается в зависимости от лица, запрашивающего сведения, и формы предоставления сведений.

На базе нашего центра заказать эти выписки можно обратившись по услуге

«Предоставление сведений, содержащихся в Едином государственном реестре недвижимости (ЕГРН)».
Для оформления услуги в центре «Мои Документы» Вам необходимо представить следующие документы:

  1. Документ, удостоверяющий личность заявителя, либо личность представителя физического лица;
  2. Акт (протокол, приказ) об избрании руководителя — предоставляется в случае обращения представителя юридического лица, имеющего право действовать без доверенности;
  3. Квитанция об оплате.

На базе центра «Мои Документы» услуга предоставляется в течение 5 рабочих дней

Получить реквизиты и узнать о стоимости платы за предоставление сведений из ЕГРН Вы можете здесь.
Результатом услуги является: Выписка из ЕГРН


Также сообщаем, что на Портале госуслуг Якутии открылся новый сервис для физических лиц, где можно заполнить заявление на получение выписки из ЕГРН и получить талон на предварительную запись в офисе центра «Мои Документы». *
Для заполнения форм зайдите на Портал по адресу: https://e-yakutia.ru
Выберите сервис, расположенный на правом верхнем баннере «Сведения из ЕГРН»
Далее просмотрите информацию, нажмите «Начать предварительное заполнение формы запроса о предоставлении сведений из ЕГРН» и выберите вид сведений
Заполните форму запроса ЕГРН и нажмите «Отправить»

После отправки заявления в течение 1 рабочего дня с момента подачи заявления Вам будет направлена информация с подробной инструкцией о дальнейших действиях-назначенное время и дату для последующего довнесения оригиналов документов, либо об исправлении введенных данных (при необходимости). Подача такого заявления временно возможна только в головном офисе центра «Мои Документы», расположенном по адресу: г. Якутск, ул. Аммосова, д. 18.

Дополнительно уведомляем, что по данной услуге Вы можете подать заявление электронно не выходя их дома!
Для оформления услуги в электронном виде через официальный сайт Федеральной службы государственной регистрации, кадастра и картографии пройдите по следующей ссылке: https://rosreestr.ru/site/eservices/;

Заполните электронную форму заявления.

При заполнении электронной заявки способ получения готового результат Вы выбираете самостоятельно: в виде электронного документа на электронный адрес, в виде бумажного документа почтовым отправлением, в виде бумажного документа в территориальном органе Управления Росреестра.

Отчет об объекте недвижимости основанный на выписке ЕГРН

Отчет об объекте недвижимости основанный на выписке ЕГРН

-13. бетулиновые кислоты, карбоновые кислоты, сложные эфиры, альдегиды, эллаговая кислота, бензойная кислота, o -кумаровая кислота, рутин, мирицетин и кверцетин [10–12].Виды C. uvifera , C. cereifera и C. mollis были оценены как ларвицидные средства против комаров Aedes aegypti [13], а также противогрибковые [14], цитотоксические [15], противомикробные средства. [10], древесные биофунгицидные и фитопатогенные бактериальные [12].

Coccoloba alnifolia , широко известная как «pau-de estalo» или «cabuçu», является одним из эндемичных бразильских видов этого рода. Несмотря на все эти виды использования в традиционной народной медицине, нет никакой научной информации о составе вторичных метаболитов C.alnifolia , ни об их возможной биологической активности. Целью этого исследования было охарактеризовать химический состав и антиоксидантную активность экстрактов C. alnifolia с использованием моделей in vitro и in vivo . Пять экстрактов листьев были получены путем последовательной экстракции (с использованием аполярных растворителей в полярные растворители), а шестой экстракт был приготовлен только с водой (исходя из народного использования). В целом эти экстракты не влияли на жизнеспособность шести различных клеточных линий млекопитающих.Кроме того, анализы in vitro, и in vivo, показали четыре полярных экстракта, EE, ME, WEE и WE, которые были источниками молекул антиоксидантов. Более того, экстракты EE и WE не влияли на плодовитость нематод Caenorhabditis elegans , использованных в качестве тестовой модели. Таким образом, листья Coccoloba alnifolia обладают отличным потенциалом для разработки лекарственных трав и в качестве антиоксидантных продуктов.

2. Материалы и методы
2.1. Реагенты

Феррицианид калия, сульфат железа II, трихлоруксусная кислота и серная кислота были приобретены у Merck (Дармштадт, Германия).Нитро-синий тетразолий (NBT), моносахариды, диаминоэтантетрауксусная кислота (EDTA), D-глюкоза, галловая кислота, аскорбиновая кислота, белок бычьего сывороточного альбумина, аскорбиновая кислота, метионин, 3- (4,5-диметилтиазолил-2) -2,5 — дифенилтетразолийбромид (МТТ), пирокатехиновый фиолетовый, рибофлавин, молибдат аммония и трет-бутилпероксид водорода (t-BOOH) были приобретены у Sigma-Aldrich Co. (Сент-Луис, Миссури, США). Бикарбонат натрия, заменимые аминокислоты и фосфатно-солевой буфер (PBS) были приобретены у Invitrogen Corporation (Burlington, ON, Canada).Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), и фетальная бычья сыворотка (FBS) были получены от CULTILAB (Campinas, SP, Brazil). Пенициллин и стрептомицин были получены от Gibco (Форт-Уэрт, Техас, США). Все остальные растворители и химические вещества были аналитической чистоты от Synth (Diadema, SP, Бразилия).

2.2. Растительный материал

Coccoloba alnifolia зрелых листьев были собраны в мае 2015 г. с образца, расположенного в Парке дас Дунас, Натал, RN, Бразилия (зона UTM 250257315 м E 9357108 м N — GPS Garmin Etrex).Этот регион соответствует биому Атлантического леса. После идентификации в Гербарий УФРН был депонирован чек за номером: УФРН 17133. Исследование было зарегистрировано в СИСБИО за №. 54064-1, SISGEN нет. A39FD4C.

2.3. Приготовление экстрактов

После сбора урожая свежие листья были разделены на мелкие кусочки и перенесены в колбу в соотношении 1:10 () (100 г свежих листьев на 1000 мл растворителя) для мацерации в течение 24 часов для каждого использованного растворителя. . Метод последовательной экстракции был осуществлен с использованием различных растворителей в следующем порядке от аполярных до полярных растворителей, таких как гексан (HE), хлороформ (CE), этанол (EE), метанол (ME) и водный экстракт (WEE).Подход, использованный для приготовления экстрактов, заключался в последовательной экстракции с использованием различных растворителей, при которой листья мацерировали, и добавляли каждый растворитель (аполярный к полярным растворителям) в течение 24 часов. Затем листья фильтровали и возвращали в колбу, и добавляли следующий растворитель. Таким образом, водный экстракт (WEE) соответствует последнему растворителю, используемому для этой последовательной экстракции. Идея последовательной экстракции отделила соединение на основе растворителя. Кроме того, экстракт, приготовленный с использованием только воды — WE — был основан на народном использовании.

Для предотвращения легкого разложения колбу покрывали алюминиевой фольгой. Затем его помещали на встряхивающий стол при 150 об / мин на 24 ч при 24 ° C (Tecnal Shacker). Экстракт фильтровали через ватман № 1. Листья переносили обратно в колбу со следующим растворителем после серийной экстракции в тех же условиях. Экстракты сушили в ротационном испарителе (Tecnal – TE 210) при 40 ° C. Экстракты восстанавливали в 1% ДМСО (Merck), затем лиофилизировали (Labconco FreeZone 4.5). Все экстракты ресуспендировали в воде до конечной концентрации 100 мг / мл (исходный экстракт) и хранили при -18 ° C до использования.

2.4. Общее содержание сахара, фенольных соединений и белка
2.4.1. Общее количество сахаров

Для проверки количества сахаров в экстрактах использовали метод фенола-H 2 SO 4 и D-глюкозу (Sigma-Aldrich) в качестве стандарта. Общее количество сахаров измерялось при 490 нм (Hitachi U-2000 Tokyo, Japan) [16].

2.4.2.Общее количество фенольных соединений

Общее содержание фенольных соединений измеряли с использованием метода Folin Ciocalteu, и галловую кислоту (Sigma-Aldrich) использовали в качестве стандарта. Его измеряли при 765 нм (BioTek Epoch Microplate, Калифорния, Калифорния, США) [17].

2.4.3. Общие растворимые белки

Общее содержание белка измеряли с использованием метода Брэдфорда, и белок бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich) использовали в качестве стандарта. Реакцию измеряли при длине волны 595 нм (BioTek Epoch Microplate, Калифорния, Калифорния, США) [18].

2,5. Антиоксидантная активность in vitro

Каждый анализ антиоксиданта проводили в трех экземплярах и повторяли три раза. Все показания были сделаны с использованием спектрофотометра BioTek Epoch Microplate (Калифорния, Калифорния, США). Экстракты из C. alnifolia использовали в концентрации 250, мк, г / мл.

2.5.1. Общая антиоксидантная способность (TAC)

Антиоксидантную активность измеряли с учетом восстановления Mo +6 до Mo +5 растительными экстрактами и последующего образования комплекса зеленый фосфат / Mo +5 при кислом pH.Используемая концентрация экстракта составляла 250 мкг ( г / мл), который был смешан с 600 мМ серной кислоты молибдата аммония), и его инкубировали при 100 ° C в течение 90 мин [19]. По истечении этого времени смесь выдерживали при комнатной температуре для охлаждения и измеряли оптическую плотность при 695 нм. Результаты сравнивали с отрицательным контролем (дистиллированная вода). Общая антиоксидантная способность выражалась в эквивалентах аскорбиновой кислоты (ЕАА / г).

2.5.2. DPPH

Антиоксидантную активность определяли по способности антиоксидантов, присутствующих в образцах, улавливать радикал DPPH [20].Экстракт добавляли в концентрации 250 мкл г / мл и 100 мкл л DPPH (0,1 мМ). Смесь интенсивно перемешивали и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. Затем измеряли оптическую плотность при 517 нм. Бланковый контроль представлял собой 99,5% этанол (Synth, Бразилия), а отрицательный контроль — дистиллированная вода. Активность по поглощению DPPH рассчитывали следующим образом:.

2.5.3. Анализ с восстановительной мощностью

Восстанавливающую способность образцов оценивали по восстановлению феррицианида калия до ферроцианида калия [21].Растительный экстракт с концентрацией 250, мк, г / мл добавляли к раствору, содержащему 0,2 М фосфатный буфер (pH 6,6) и феррицианид калия (1%) в конечном объеме 4 мл. Реакцию инкубировали при 50 ° C в течение 20 мин; по истечении этого периода его прекратили добавлением раствора TCA (10%). Затем раствор смешивали с дистиллированной водой и хлоридом железа (0,1%). Поглощение измеряли при 700 нм. Фосфатный буфер использовали в качестве холостого контроля. Результат был выражен в процентах от активности, представленной цифрой 0.1 мг / мл аскорбиновой кислоты (стандарт — Sigma-Aldrich).

2.5.4. Активность по поглощению супероксида

Анализ основан на способности экстрактов ингибировать фотохимическое восстановление нитросинего тетразолия (NBT) в систему рибофлавин-свет-NBT [21, 22]. Для этого экстракт с концентрацией 250 мкМ г / мл был добавлен в 50 мМ фосфатный буфер (pH 7,8), 13 мМ метионин, 100 мМ ЭДТА, 75 мМ NBT и 2 мМ рибофлавин. После этого раствор подвергали воздействию люминесцентной лампы в течение 10 минут.Изменение цвета на синий связано с образованием формазана, и его отслеживают по поглощению при 560 нм. В спектрофотометре. ЭДТА использовали в качестве контроля, а дистиллированную воду — в качестве холостого опыта. Результаты выражали в процентах поглощения:

2,6. Жизнеспособность клеток — анализ МТТ

Влияние экстрактов C. alnifolia на жизнеспособность клеток оценивали. Использовали одну неопухолевую клеточную линию: NIH / 3T3 (ATCC CRL-1658 — мышиный фибробласт), а также пять линий опухолевых клеток: HeLa (ATCC CCL-2 — клетка аденокарциномы матки человека), SiHa (ATCC HTB-35— клетка плоскоклеточной карциномы человека), PC-3 (ATCC CRL-1435 — клетка аденокарциномы простаты человека), B16-F10 (ATCC CRL-6475 — клетка меланомы кожи мыши) и PANC-1 (ATCC CRL-1469— клетки аденокарциномы поджелудочной железы).Сначала клеточные линии выращивали в культуральных колбах с использованием среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением FBS (10%) и антибиотиков (100 Ед / мл пенициллина и 100 мкл г / мл стрептомицина). Эти культуральные колбы поддерживали в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 при 37 ° C. Чтобы оценить влияние экстракта на жизнеспособность клеток, клетки переносили в 96-луночные планшеты по количеству клеток на лунку до тех пор, пока они не достигли слияния. Экстракты (HE, CE, EE, ME, WEE и AE) добавляли при 0, 100, 250 или 500 мк г / мл в течение 24 ч при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2 .После периода инкубации среду заменяли на 100 мкл л МТТ (1 мг / мл, растворенный в DMEM). Затем клетки инкубировали в течение 4 ч в атмосфере 5% CO 2 при 37 ° C. Затем лунки отсасывали и кристаллы формазана солюбилизировали добавлением 100 90 213 мкл 90 214 л этанола на лунку [23, 24]. Планшет считывали при поглощении 570 нм с использованием спектрофотометра для микропланшетов Epoch (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA). Жизнеспособность клеток определяли и сравнивали с отрицательным контролем (только DMEM), используя следующую формулу:, в которой соответствовало поглощение экспериментальной группы, и было поглощение отрицательного контроля.

2.7. Антиоксидантная активность in vivo
2.7.1.
Caenorhabditis elegans — Поддержание и лечение

C. elegans N2 (линия дикого типа) был получен из Центра генетики Caenorhabditis (Университет Миннесоты, США) и содержался в среде для выращивания нематод (NGM), засеянной Escherichia coli OP50 при 20 ° C по Бреннеру [25]. Черви синхронизировали с помощью отбеливающего раствора в беременных гермафродитах (NaOCl 1%, NaOH 0.25 M), чтобы иметь животных на стадии L1 (Sulston, Hodgkin, 1988). Для лечения экстракты EE и WEE фильтровали с использованием фильтра 0,22 мкм мкм (Merck) и добавляли к NGM в конечных концентрациях 1 или 10 мг / мл. Синхронизированные L1 культивировали на чашках NGM, содержащих экстракты, и засевали E. coli OP50 в течение 48 часов при 20 ° C, пока они не достигли стадии L4.

2.7.2. Токсичность для
Caenorhabditis elegans Яйца

Для этого анализа 30 яиц помещали в три чашки NGM, содержащие EE и WEE при 0, 1 и 10 мг / мл, и хранили при 20 ° C в течение 48 часов.После этого подсчитывали количество L4 и яиц. Этот анализ был проведен в трех независимых анализах с общим количеством 90 яиц на группу.

2.7.3. Анализ окислительного стресса

Анализ окислительного стресса проводили с использованием трет-бутилпероксида водорода (t-BOOH) в качестве продуцента АФК [26, 27]. Сорок червей на стадии L4 обрабатывали EE и WEE в концентрациях 0, 1 и 10 мг / мл в течение 48 ч при 20 ° C. После этого червей переносили в 12-луночный планшет, содержащий буфер M9 с 8 мМ t-BOOH, и оценивали каждые полчаса.Те черви, которые не реагировали на раздражитель, считались мертвыми (без движения). Некоторые черви подвергались цензуре, что означает, что червь не был обнаружен или умер по причинам, отличным от окислительного стресса. Эти анализы были выполнены в пяти независимых анализах.

2,8. Тонкослойная хроматография (ТСХ)

Для анализов использовали хроматопланшеты с силикагелем. Используемые подвижные фазы были следующими: (i) этилацетат: муравьиная кислота: вода (8: 0,8: 1,), (ii) этилацетат: муравьиная кислота: метанол: вода (10: 0.5: 0,6: 0,2,) и (iii) толуол: этилацетат: муравьиная кислота (5: 5: 0,5,). Визуализация соединений была достигнута путем распыления растворов серного ванилина, 0,5% натурального реагента А (дифенилборилоксиетиламина), 1% хлорида железа в метаноле и Драгендорфа. Стандарты, используемые при ТСХ, были следующими: кверцетин, урсоловая кислота, галловая кислота, изокверцетин, хлорогеновая кислота, эллаговая кислота, изокверцитрин, лютеонин, канферол, рутин, кофейная кислота, катехин, ориентин, изоориентин, витексин и изовитексин (сигмаитексин (сигмаитексин). ).Затем наблюдали за цветом, измеряли коэффициент удерживания (Rf) пятен и сравнивали его с литературными данными [28]. Для ME и EE была проведена Co-TLC для подтверждения присутствия гликозидных флавоноидов, витексина и изовитексина.

2.9. Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC-DAD)

WE анализировали с помощью HPLC-DAD (Agilent 1260), снабженного колонкой C18 (Zorbax-). Элюирование проводили градиентом 0,1% уксусной кислоты (A) и ацетонитрила (B) следующим образом: 10% B (0-6 мин), 10-15% B (6-7 мин), 15% B (7 мин.). -22 мин), от 15 до 50% B (22-32 мин), от 50 до 100% B (32-42 мин) и 100% B (42-50 мин) при постоянной скорости потока 1 мл / мин .Образец был приготовлен из расчета 1 мг / мл с использованием метанола (степень чистоты для ВЭЖХ), и объем впрыска составлял 3 мк л. Температура колонки составляла 45 ° C, и детектирование проводили при 228, 254, 280, 290, 320. , 340 и 352 нм. Идентификация фенольных соединений была получена путем сравнения времени удерживания и спектров поглощения в УФ-видимой области со стандартными соединениями.

В HPLC-DAD использовались следующие стандарты: 3-гидроксикоричная кислота (501-52-0), бензойная кислота (65-85-0), кофейная кислота (331-39-5), коричная кислота 92 ( 621-82-9), хлорогеновая кислота (327-97-9), эллаговая кислота (476-66-4), феруловая кислота (1135-93 24-6), галловая кислота (149-91-7), гентизиновая кислота (490-79-9), о-кумаровая кислота (583-17-5), пара-кумаровая кислота (501-98-4), розмариновая кислота (20283-92-5), синаповая кислота (530-59-6 ), апигенин (520-36-5), апиин-апигенин-7- (2-O-апиозилглюкозид) (26544-34-3), кемпферол (520-18-3), кемпферол 3-OD-галактозид (23627- 87-4), 3-O-метилкаемпферол (1592-70-7), биоробин-кемпферол 3-O- β -робинобиозид (17297-56-2), никотифлорин-кемпферол 3-O- β рутинозид ( 17650-84-9), катехин (154-23-4), хризин-5,7-дигидроксифлавон (480-40-0), хризоэриол-3-O-метиллутеолин (491-71-4), даидзеин-4, 7-дигидроксиизофлавон (486-66-8), эпикатехин (490-46-0), генистеин-4,5,7-тригидроксиизофлавон (446-72-0), госсипетин-8-гидроксикверцетин (489-35-0), час эсперидин (520-26-3), гесперитин (520-33-2), гистидулин-6-метоксиапигенин (1447-88-7), гомоориентин-лютеолин 6-C- β -D глюкозид (4261-42-1 ), изорамнетин 3-O- β -галактозид (6743-92-6), изорамнетин 3-O- β -D-глюкозид (5041-82-7), кейозид — изорамнетин 3-O-робинобиозид (107740 -46-5), нарциссин-изорамнетин 3-O- β рутинозид (604-80-8), лютеолин (491-70-3), мирицетин (529-44-2), нарингенин (480-41-1 ), неогесперидин (13241-33-3), ориентин-лютеолин-8-C-глюкозид (28608-75-5), кверцетагетин-7-O-глюкозид (548-75-4), кверцетин (117-39-5) , гиперин-кверцетин 3-O- β -галактозид (482-36-0), изокверцетрин-кверцетин 3-O- β -глюкозид (482-35-9), кверцетин 3-O- β — гентиобиозид (7431-83-6), кверцетин-3-O-робинобиозид (52525-35-6), кверцитрин-кверцетин-3-O-рамнозид (522-12-3), рамнетин (90-19-7), рутин- кверцетин 3-O- β -рутинозид (153-18-4), таксифолин-дигидрокверцетин (480-18-2), тилирозид-ка эмпферол 3-O- (6-O-п-кумароил) глюкозид (20316-62-5) и витексин-апигенин 8-C114 глюкозид (3861-93-4).Другие стандарты соответствуют библиотеке, созданной в лаборатории фитохимии факультета ботаники Университета Сан-Паулу.

2.10. Биоинформатический анализ

С помощью анализов ТСХ наблюдали присутствие двух гликозидных флавоноидов — витексина и изовитексина в экстрактах листьев C. alnifolia . Эти соединения были использованы для поиска в базе данных системной фармакологии традиционной китайской медицины (TCMSP) для генов-мишеней [29]. Данные, полученные в TCMSP, были использованы в базе данных Kyoto Encyclopedia Genes and Gnome (KEGG) [30].Пути, идентифицированные в KEGG, были перечислены в порядке убывания их стоимости. Эти данные использовались для построения сети с использованием String 10 версии 11 (https://string-db.org/).

2.11. Статистический анализ

Все результаты были выражены как. Каждый анализ проводили в трех или пяти экземплярах, и каждый повторяли не менее 3 раз. Статистический анализ выполняли с использованием GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) с использованием вариационного анализа (односторонний дисперсионный анализ) и пост-теста Тьюки для сравнения различных групп.Различия со значениями ≤ 0,05 считались достоверными.

3. Результаты
3.1. Общее содержание сахара, фенольных соединений и белка

Пять экстрактов были получены в последовательности от неполярного до полярного: гексан (HE), хлороформ (CE), этанол (EE), метанол (ME) и водный экстракт (WEE). ), а шестой — только с водно-водной вытяжкой (WE). Таблица 1 показывает, что общее количество фенольных соединений варьировалось от 2,3 мк г / г до 61,26 мк г / г, в порядке HE мк г / г до 225,00 мк г / г, порядок был CE мк г / г.

0 4,94
Экстракты Сахар ( μ, г / г) Фенольные соединения ( μ г / г) Белки (4 μ)
Гексан (HE) 34.35 2,30 1,4
Хлороформ (CE) 33,45 10,54 1,1
Этанол (EE) 183,81
225,00 61,26 4,5
Вытяжка на конце воды (WEE) 128.60 33,63 2,8
Водная вытяжка (WE) 198,5667 2,0
3.2.
In vitro Антиоксидантная активность

Учитывая присутствие фенольных соединений и понимание того, что эти фитохимические вещества могут быть связаны с антиоксидантной активностью, антиоксидантный потенциал каждого из шести экстрактов C. alnifolia был проанализирован с использованием четырех анализов: общая антиоксидантная способность ( TAC), метод свободных радикалов DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразилгидрат), тест на снижение мощности и активность по улавливанию супероксида.

Анализ TAC оценивал способность образца отдавать электроны и, таким образом, нейтрализовать реактивные частицы. Самые высокие значения TAC были обнаружены для ME (111,38 EEAq мг) и EE (96 EEAq мг). WEE (58,25 EEAq мг) и WE (59,89 EEAq мг) представили эквивалентные результаты (рисунок 1 (a)). Для анализа DPPH антиоксидантная активность варьировала от 49% до 114% (рис. 1 (b)). Более того, полярные экстракты показали самую высокую активность для анализа восстанавливающей силы, для которого значения варьировались от 83,9% до 105.4% (рисунок 1 (в)). Аналогичный результат также наблюдался для анализа улавливания супероксидных радикалов, где самые высокие значения наблюдались для полярных экстрактов, и эти значения варьировались от 76,4% до 91% (рис. 1 (d)).

Анализ коэффициента Пирсона

показал положительную корреляцию между содержанием фенольных соединений в экстрактах C. alnifolia и антиоксидантными анализами. Наблюдалась сильная корреляция между TAC и анализом восстановительной мощности (см. Таблицу 1) и умеренная корреляция с улавливанием супероксидных радикалов.Кроме того, содержание сахара показало очень сильную корреляцию для анализа снижения мощности и TAC и умеренную корреляцию с улавливанием супероксидных радикалов (см. Таблицу 1).

3.3.
In vivo Analysis

Данные описанных выше антиоксидантных анализов побудили нас провести антиоксидантные анализы in vivo . Однако перед проведением этих анализов необходимо было оценить токсический потенциал этих экстрактов, чтобы исключить возможное вредное воздействие на животных, использованных в экспериментах in vivo .Затем были проанализированы их эффекты на неопухолевые клетки 3T3 и пять линий опухолевых клеток, HeLa, SiHa, PC-3, B16-F10 и PANC-1. После этого Caenorhabditis elegans использовали в качестве модели in vivo .

3.3.1. Жизнеспособность клеток

Для клеточных линий было оценено влияние шести экстрактов на три концентрации (100 мк г / мл, 250 мк г / мл и 500 мк г / мл) (Рисунок 1) . Эти экстракты не оказали никакого влияния на жизнеспособность клеток ни при одной из трех проанализированных концентраций.Однако для ME и WEE наблюдалось снижение жизнеспособности неопухолевых клеток примерно на 25-35% (ME при 250 или 500 μ г / мл и для WEE при 500 μ г / мл) ( Таблица 2). Кроме того, для линий опухолевых клеток в целом не было значительного изменения жизнеспособности клеток. Снижение жизнеспособности клеток на 10-25% для HE, CE и WE наблюдалось для клеточных линий HeLa и SiHa (таблица 2). Таким образом, в целом для линий неопухолевых и опухолевых клеток экстракты C. alnifolia не были цитотоксичными для модели in vivo клеточной линии .

9049 9049 904901 9049
04 9049 90404 9049 WE010101 9049
Экстракты Конц. Клеточные линии #
NIH / 3T3 HeLa SiHa PC-3 B16-F-10 PANC-1
250
CE 100
250
904 91
EE 100
250
ME 100
90 9049 9049 9049 9049 9049 500
WEE 100
500
WE
WE 250
500 9048 CE: хлороформный экстракт; EE: этанольный экстракт; ME: метанольный экстракт; WEE: вытяжка из воды; МЫ: водный экстракт. # NIH / 3T3: ATCC CRL-1658 — мышиный фибробласт; HeLa: ATCC CCL-2 — клетка аденокарциномы матки человека; SiHa: ATCC HTB-35 — клетка плоскоклеточной карциномы человека; PC-3: ATCC CRL-1435 — клетка аденокарциномы простаты человека; B16-F10: ATCC CRL-6475 — клетка меланомы кожи мыши; PANC-1: ATCC CRL-1469 — клетки аденокарциномы поджелудочной железы.

3.3.2. Токсичность
C. elegans Яйца

Caenorhabditis elegans имеет непроницаемую кутикулу, которая представляет собой внеклеточный матрикс коллагена, образующий многофункциональный экзоскелет, затрудняющий прохождение веществ [31].Из-за этого использовались более высокие концентрации экстракта по сравнению с анализами клеточных линий. Принимая во внимание результаты, полученные с антиоксидантами и с клеточными линиями, для оценки были выбраны экстракты EE и WE. Для этой модели концентрации экстракта 1 и 10 мг / мл использовались для оценки возможного токсического воздействия на вылупление яиц (рис. 2). По сравнению с контролем, у которого вылупление яиц составляло 70%, оба экстракта, WE и EE, имели аналогичный эффект при дозах 1 мг / мл и 10 мг / мл в диапазоне от 70% до 91% (рис. 2).Следовательно, EE и WE не оказали токсического действия на вылупление яиц в модели C. elegans .


3.3.3.
In vivo Антиоксидантная активность с использованием C . elegans Модель

Поскольку экстракты EE и WE не оказывали токсического воздействия на вылупление яиц и развитие эмбрионов, эти экстракты были исследованы на предмет их антиоксидантного действия in vivo на C. elegans . Для этих анализов использовали диких животных (N2), которым вводили EE и WE в концентрации 1 и 10 мг / мл.Впоследствии эти черви были проанализированы на выживаемость в условиях окислительного стресса (обработка трет-бутилгидропероксидом (t-BOOH)). Повышенная толерантность к условиям окислительного стресса, которым способствовала обработка t-BOOH, наблюдалась при обработках EE и WE (Фигуры 3 (a) и 3 (b)). Для контрольных животных, получавших EE, среднее время выживания составляло 7,5 ч по сравнению со средним временем выживания 10,5 ч для EE (1 мг / мл и 10 мг / мл), что указывает на увеличение на 28,6% (таблица 3). .

Условия выживания Среднее время выживания (часы) Вариация среднего значения выживаемости (%) Значение-Лог-ранговые тесты (Mantel-Cox) Число погибших животные / цензура
Контроль 7,5 80/0
EE 1 мг / мл 10,5 28,6 9048 EE 10 мг / мл 10.5 28,6 <0,0001 80/0

Для контрольных животных в обработках WE среднее время выживания составляло 4,8 ч по сравнению с 7,9 ч и 8,2 ч для 1 мг / мл и 10 мг / мл WE, соответственно (рис. 3 (б)). Эта разница представляет собой увеличение на 39,2% (1 мг / мл) и 41,3% (10 мг / мл) при обработке t-BOOH (таблица 4).

Условия выживания Среднее время выживания (часы) Вариация среднего значения выживаемости (%) Значение-Лог-ранговые тесты (Mantel-Cox) Число погибших животные / цензура
Контроль 4.8 80/0
WE 1 мг / мл 7,9 39,2 <0,0001 80/0
WE 10 мг / мл 41 8,2 0,0001 80/0
3.4. Фитохимические соединения, идентифицированные с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ)

Анализ ТСХ показал, что присутствие фенольных соединений, таких как флавоноиды и их соединения, может быть связано с антиоксидантной активностью, наблюдаемой в анализах in vitro и in vivo .Когда хроматопластинки были обнаружены с использованием серного ванилина, наблюдались красочные пятна сапонинов (CE, EE, ME и WE) и терпенов (CE, EE и ME). Кроме того, на хроматопланшетах, контактирующих с раствором хлорида железа, появлялись пятна, свидетельствующие о наличии фенольных соединений в полярных экстрактах (EE, ME, WEE и EE), а с помощью Natural A Reagent присутствие флавоноидов в полярных экстрактах было наблюдается (EE, ME, WEE и WE). Чтобы идентифицировать некоторые соединения, присутствующие в полярных активных экстрактах, стандарты были использованы в анализе ко-ТСХ, а витексин (зеленый флуоресцентный) и изовитексин (зеленый флуоресцентный) были обнаружены в EE и ME.Наблюдалось присутствие фенольных и флавоноидов во всех полярных экстрактах, особенно EE и ME.

3.5. WE Chemical Profile by HPLC-DAD

Основываясь на результатах, полученных с помощью анализов in vitro и in vivo для EE и WE и традиционного народного способа получения экстрактов путем мацерации в воде, мы выбрали WE для дальнейшей характеристики с помощью высокой — высокопроизводительная жидкостная хроматография (HPLC-DAD), поскольку ТСХ показала присутствие витексина и изовитексина.

HPLC-DAD показал несколько пиков (рис. 4), которые оценивали при различных УФ-спектрах (228–352 нм).При сравнении со стандартами пик №2 соответствовал галловой кислоте (-280 нм), пик №16 соответствовал p, -кумаровой кислоте (-280 нм), а пик №19 — витексину (-280-352 нм). Присутствие витексина согласуется с данными ТСХ.


3.6. Биоинформатический анализ

Биоинформатика — отличный инструмент для сбора данных о потенциальных целях с учетом двух биоактивных молекул, которые были идентифицированы в экстрактах C. alnifolia : витексин и изовитексин.База данных Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) использовалась для определения возможных мишеней для этих биоактивных молекул. Эти молекулы могут быть связаны с путями, связанными с иммунной системой, сердечно-сосудистыми заболеваниями, сигнальными путями, раком, нервной системой и другими. Было выполнено более 32 целей (таблица 5). Когда было проанализировано перекрытие между мишенями, наблюдались несколько генных мишеней, таких как IKBKB, PTGS2, RELA, TNF, MAPK7, AR и NF-B (таблица 5 и рисунок 5). Кроме того, биоинформатический подход предполагает, что биоактивные молекулы, идентифицированные в C.alnifolia может обладать как антиоксидантной, так и противовоспалительной активностью.

011 12
KEGG Brite ( Homo sapiens ) Скорректированное значение Скорректированное значение Связанные гены (цели)
2.36-10 IKBKB; PTGS2; RELA; TNF; MAPK7
Передача сигнала 1.37-09 6.97-08 ИКБКБ; ПТГС2; РЕЛА; TNF; MAPK7
Сердечно-сосудистые заболевания 4.96-09 1.30-07 IKBKB; RELA; TNF; MAPK7
Лекарственная устойчивость: противоопухолевый 1.68-08 1.68-08 IKBKB TNF
Вирусная инфекционная болезнь 3.30-08 6.17-07 IKBKB; PTGS2; RELA; TNF
Инфекционная болезнь: бактериальная 8.65-07 5.67-06 IKBKB; RELA; TNF
Инфекционное заболевание паразитарное 2.05-07 2.24-06 PTGS2; RELA; TNF; IKBKB
Эндокринная система 1.67-07 2.08-06 IKBKB; RELA; TNF
Сигнальный путь 1.74-07 2.08 IELKA Развитие и восстановление 1.02-06 6.37-06 IKBKB; RELA; TNF
Болезнь человека: рак 4.00-07 4.03-06 IKBKB; PTGS2; RELA; MAPK7
Эндокринные заболевания и нарушения обмена веществ 6.20-07 4.77-06 IKBKB; RELA; TNF
Нервная система 8.24-07 5.6790 IKB 5.67-06
Рост и гибель клеток 1.22-06 7.27-06 IKBKB; RELA; TNF

4.Обсуждение

Coccoloba alnifolia использовалась в народной медицине на северо-востоке Бразилии, но нет никакой научной информации о ее химическом составе или антиоксидантной активности. В этом исследовании химический состав и биологическая активность экстрактов шести листьев были охарактеризованы с использованием ряда растворителей (от аполярного до полярного серийного подхода) [32]. Химический анализ показал наличие сахаров, белков и фенольных соединений. Доля этих компонентов варьировалась в экстрактах; Экстракты EE, ME, WEE и WE содержали большое количество сахара и умеренное присутствие фенольных соединений, тогда как протеин был очень низким во всех экстрактах.

Alam et al. [5] показали, что полярные растворители хороши для извлечения фенольных соединений, а представленные здесь данные показали более высокие концентрации фенольных соединений и флавоноидов в этих экстрактах (EE, WE, ME, WEE и WE). ТСХ также показала присутствие терпенов (CE, EE, ME и WE) и сапонинов (CE, EE, ME и WEE). При совместной ТСХ наблюдали присутствие витексина и изовитексина, тогда как ВЭЖХ-ДАД показала присутствие галловой кислоты, p, -кумаровой кислоты и витексина для WE.Хотя эти соединения были идентифицированы ранее у других видов Coccoloba [10, 33, 34], наши результаты являются первыми, чтобы сообщить об их присутствии у C. alnifolia . Исходя из этого, важно оценить антиоксидантную активность и другие биологические активности экстрактов C. alnifolia , которые содержат смесь биоактивных молекул, помимо витексина и изовитексина, которые были идентифицированы с помощью ко-ТСХ [35] и ВЭЖХ-ДАД для МЫ.

Полученные здесь результаты показали превосходный антиоксидантный потенциал для EE, ME, WEE и WE, особенно в отношении снижения мощности и улавливания свободных радикалов DPPH.TAC показал более высокую антиоксидантную активность в отношении EE и ME. DPPH оценивал способность образца улавливать свободные радикалы DPHH, и как анализ снижения мощности, так и анализ TAC анализировали способность образца отдавать электроны. Gusman et al. [34] наблюдали антиоксидантную активность с помощью анализа DPPH для C. cereifera, и антиоксидантную активность с использованием DPPH также наблюдали для других видов из Polygonaceae, таких как Rumex japonicus [36] и Polygonum maritimum [37].Эти виды использовались в традиционной медицине в Азии, Европе и Африке, подтверждая данные, полученные здесь для C. alnifolia . Антиоксидантный потенциал может быть связан с фенольными соединениями, а также с сахарами, присутствующими в экстракте, как показано корреляциями Пирсона. Выявленные сахара могут быть связаны с фенольными соединениями, которые связаны с молекулами сахара, такими как флавоноидные гликозиды, конденсированные танины и гликозидные тритерпены, что может объяснить присутствие сахаров в C.alnifolia [38, 39]. Антиоксидантный потенциал, наблюдаемый для этих экстрактов, может быть связан с различными биоактивными молекулами, которые могут действовать, улавливая свободные радикалы и уменьшая действие АФК на клетки, следовательно, поддерживая баланс между производством и деградацией [35, 40, 41].

Анализы in vitro показали, что C. alnifolia обладают интересным антиоксидантным потенциалом, а анализов in vivo с использованием клеточных линий показали, что в целом шесть экстрактов не были цитотоксичны ни для линий неопухолевых клеток 3T3, ни для Hela, SiHa. , Линии опухолевых клеток PC-3, B16-F10 и PANC.С другой стороны, Tsuboy et al. [15] наблюдали, что экстракты корней C. mollis были более цитотоксичными, чем экстракты листьев, в отношении линий опухолевых клеток HTC. He et al. [42] показали, что витексин и изовитексин являются прекрасными антиоксидантными молекулами и обладают широким спектром антиоксидантных, антипролиферативных, противовоспалительных и других свойств. Более того, было подтверждено, что экстракты из C. uvifera и C. cereifera обладают провоспалительной активностью и могут действовать на фактор некроза опухоли α (TNF- α ) [33, 34].Используемый здесь биоинформатический подход с учетом присутствия витексина и изовитексина предполагает, что экстракт C. alnifolia может действовать на TNF- α и простагландин-эндопероксидсинтазу (PTGS или COX). Habtemariam [35] упомянул, что экстракты представляют собой смесь биоактивных молекул, которые могут действовать синергетически или по отдельности. Кроме того, было обнаружено, что природные продукты могут действовать на сигнальные пути, например, на сигнальный путь NF- κ B [4, 35, 43–45].Данные биоинформатики с использованием витексина и изовитексина показали, что некоторые гены-мишени были противовоспалительными генами, такими как NF- κ B и COX-2.

Кроме того, было показано, что Caenorhabditis elegans является отличной моделью для определения токсичности химических соединений. Есть некоторые анализы, которые могут показать токсичность, например, вылупление яиц и развитие нематод [46, 47]. Полученные результаты показали, что EE и WE не были токсичными, потому что они не влияли на вылупление яиц, и эти экстракты обладали защитным эффектом от окислительного стресса, когда t-BOOH использовался в качестве стрессорного агента.Эти экстракты увеличивали выживаемость на 28% для EE 1 мг / мл, на 31% для WE 1 мг / мл и на 42% для WE 10 мг / мл по сравнению с контрольными животными. Юэ и др. [48] ​​наблюдали, что p -кумаровая кислота способна снижать окислительный стресс у C. elegans , а также увеличивать продолжительность их жизни в условиях окислительного стресса, аналогично тому, что наблюдалось в EE и WE. Choubey et al. [49] показали отличную от галловой кислоты активность из-за ее антиоксидантного потенциала. Таким образом, p -кумаровая кислота, галловая кислота и витексин могут быть некоторыми из биоактивных молекул, присутствующих в нашем экстракте, которые обладают антиоксидантным потенциалом и не обладают токсичностью, как показано в данных, представленных здесь для экстрактов Coccoloba alnifolia .

Другие исследования показывают, что фенольные соединения принадлежат к роду Coccoloba . Cota [10], работавший с C. acrostichoides , идентифицировал бетулин и β -ситостерин с помощью ТСХ. Ashmawy et al. [12] при работе с листьями C. uvifera обнаружили эллаговую кислоту, бензойную кислоту, —-кумаровую кислоту, рутин, мирицетин и кверцетин в экстрактах воды, ацетона и этанола. Кроме того, для C. mollis в листьях и побегах были идентифицированы тритерпенов, дитерпенов, антрахинонов, фитостероидов и бензолов [11].

Для C. alnifolia в настоящем исследовании наблюдались фенольные соединения, такие как галловая кислота, p -кумаровая кислота, витексин и изовитексин, а ВЭЖХ-DAD показала, что существует множество других соединений, которые необходимо идентифицировать. Эти экстракты могут содержать другие биоактивные молекулы, которые могут действовать синергетически с фенольными соединениями, что приводит к окислительной защите, которая снижает эффекты ROS и помогает поддерживать окислительно-восстановительный баланс (производство ROS по сравнению с деградацией ROS) в клетках и тканях [35, 40].Представленные здесь данные показывают, что EE и WE обладают большим потенциалом в качестве природных антиоксидантных продуктов.

5. Выводы

Пять экстрактов листьев Coccoloba alnifolia были получены последовательной экстракцией (с использованием аполярных растворителей в полярные растворители), а шестой экстракт был приготовлен только с водой (на основе традиционного народного использования). Полученные здесь данные показывают, что эти экстракты содержат фенольные соединения, терпены, сапонины и флавоноиды (витексин и изовитексин). В анализах in vitro и in vivo было показано, что четыре полярных экстракта, EE, ME, WEE и WE, являются источниками молекул антиоксидантов.В целом эти экстракты не влияли на жизнеспособность шести различных клеточных линий млекопитающих. Более того, EE и WE не влияли на плодовитость нематод Caenorhabditis elegans , используемых в качестве тестовой модели, и защищали их от стрессора t-BOOH, увеличивая продолжительность их жизни. Таким образом, листья Coccoloba alnifolia обладают отличным потенциалом для разработки лекарственных трав и в качестве антиоксидантных продуктов. Другие виды биологической активности также могут быть исследованы, чтобы определить, как потенциальные антиоксиданты действуют в клетках.

Доступность данных

Данные, полученные в этом исследовании, можно получить у соответствующего автора по запросу.

Конфликт интересов

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Вклад авторов

S.M.Z.L., R.P.O., H.A.O.R. и K.C.S. задумал и разработал эксперименты. L.F.M.M., D.L.G., L.F.S., L.M.P.S., M.L.M., C.O.M.C, S.M.Z.L., R.P.O., H.A.O.R. и K.C.S. провел эксперименты, проанализировал данные и написал статью.Все авторы прочитали и одобрили рукопись.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) и Ministãnologia. Авторы выражают благодарность Алин Бертинатто Крус из Лаборатории фитокимики, Департамента ботаники, Университета Сан-Паулу (USP) за помощь в анализе HPLC-DAD.H.A.O. R. и R.P.O. являются заслуженным исследователем стипендии CNPq. L.F.M.M., L.M.P.S. и C.O.M.C. получил стипендию от CAPES.

Дополнительные материалы

Дополнительная таблица 1 показывает анализ коэффициента Пирсона для сахара, белка и фенольных соединений, представленных в каждом из экстрактов Coccoloba alnifolia . Полученные значения были показаны красным цветом, и считалось, что очень сильная корреляция — значения выше 0,9, сильная корреляция — от 0,7 до 0.9. Анализ коэффициента Пирсона показал положительную корреляцию между содержанием фенольных соединений в экстракте Coccoloba alnifolia и антиоксидантным анализом. Была сильная корреляция между TAC и анализом снижающей мощности и умеренная корреляция с улавливанием супероксидных радикалов. Кроме того, содержание сахара показало очень сильную корреляцию для анализа снижения мощности и TAC и умеренную корреляцию с улавливанием супероксидных радикалов. (Дополнительные материалы)

Оценка токсичности гидроэтанольного экстракта листьев Kalanchoe brasiliensis (Crassulaceae) in vivo и in vitro

Вид Kalanchoe brasiliensis , известный как «Saião , противовоспалительное, противомикробное средство , 902 , и антигистаминная активность.Он также содержит флавоноиды кверцетин и кемпферол, которые обладают терапевтическим действием. При широком распространении, помимо определенных терапевтических свойств, необходимо изучение возможных побочных эффектов. Целью данного исследования является оценка токсичности in vitro и in vivo гидроэтанольного экстракта листьев K. brasiliensis . Действие экстракта (концентрации от 0,1 до 1000 мкл / 100 мкл) на нормальные и опухолевые клетки оценивали методом МТТ.Острую токсичность и субхроническую токсичность оценивали на мышах в дозах от 250 до 1000 мг / кг перорально в соответствии с признанными протоколами. Результаты in vitro показали цитотоксическую активность для линии клеток 3T3 (нормальных) и 786-0 (карцинома почек), показывая, что активность зависит от концентрации, достигая 92,23% ингибирования клеток. In vivo экстракт не проявил значительной токсичности; только изменения печени, связанные с острой токсичностью и некоторыми признаками поражения печени, объединение биохимических и гистологических данных.В целом экстракт показал низкую токсичность или отсутствие токсичности, представляя себя безопасным для использования с многообещающим терапевтическим потенциалом.

1. Введение

Род Kalanchoe является одним из наиболее важных родов семейства Crassulaceae, используемых в традиционной медицине, и насчитывает около 125 видов. Среди этих видов выделяется Kalanchoe brasiliensis Cambess, широко известная как «Saião» и «coirama , » и широко используется в традиционной медицине для лечения кашля, рожи и других заболеваний благодаря своим антибиотикам. -воспалительное действие [1].Вид является родным для Бразилии, распространен от Сан-Паулу на северо-восток, в основном в прибрежной зоне [1].

Что касается химического состава, основными компонентами, описанными в листе Kalanchoe brasiliensis , являются гликозилированные флавоноиды, полученные из агликона патулетина и эупафолина. [2] антимикробное и главным образом противовоспалительное действие [1–8].

Токсичность вида K. brasiliensis плохо изучена на протяжении многих лет, поэтому его значение в народной медицине и небольшое количество исследований, подтверждающих его безопасное использование, выявили необходимость проведения исследований токсичности K. brasiliensis . Таким образом, цель настоящей работы заключалась в оценке токсичности in vivo и in vitro гидроэтанольного экстракта листьев Kalanchoe brasiliensis (Crassulaceae).

2. Материалы и методы
2.1. Растительный материал

Листья Kalanchoe brasiliensis были собраны в городе Макаиба (координаты: 5 ° 51′30′′S 35 ° 21′14′′′W), Риу-Гранди-ду-Норти, Бразилия, в сентябре 2010 года. ботаническая идентификация была выполнена доктором Марией Ирасема Безерра Лойола, а ваучер был депонирован в Гербарий Центра биологических наук Федерального университета Риу-Гранди-ду-Норти, Бразилия (UFRN 5468). Сбор растительного материала проводился с разрешения Бразильской системы информации о биоразнообразии (SISBIO) (номер процесса: 35017).

Экстракт готовили и анализировали в соответствии с методологией, описанной Costa et al. (2015) и Fernandes et al. (2016) и назначен профессором д-ром Сильвана Мария Зуколотто из лаборатории фармакогнозии УФРН. Для оценки токсичности in vivo экстракт разводили в 0,9% физиологическом растворе, а для определения токсичности in vitro экстракт разводили в культуральной среде.

2.2. Животные

Протоколы экспериментов были одобрены Комитетом по этике животных Федерального университета Риу-Гранди-ду-Норти (Протокол 002/2013).Самцы и самки Swiss мышей (Mus musculus) , в возрасте 6–8 недель, массой г, содержались в виварии Центра медицинских наук УФРН при контролируемом освещении (12-часовой цикл свет / темнота) и температуре (° C). условия. Они получали воду и коммерческую пищу без ограничений.

2.3. Острая токсикологическая оценка

Случайным образом 48 животных были разделены (/ пол / группа) на экспериментальные группы, получавшие пероральные дозы 250, 500 и 1000 мг / кг, а контрольная группа получала физиологический раствор через соответствующую канюлю в виде однократной дозы [9– 11].

Мышей наблюдали в течение первых 24 часов на предмет появления каких-либо непосредственных признаков токсичности и ежедневно в течение 14 дней для наблюдения за смертью, изменениями поведения и любым острым отсроченным эффектом. Вес тела и потребление пищи и воды измеряли через день. Через 14 дней животных анестезировали тиопенталом в дозе 40 мг / кг (Tiopentax®, Cristália) внутрибрюшинно (в / б) и подвергали эвтаназии путем смещения шейных позвонков в соответствии с Правилами CONCEA от 2016 г. [12].

2.4. Субхроническая токсикологическая оценка

40 животных были рандомизированы (/ пол / группа) в экспериментальные группы, которые получали пероральные дозы 250, 500 и 1000 мг / кг в течение 30 дней, а контрольная группа получала физиологический раствор через соответствующую канюлю один раз в день. доза [10, 11, 13]. Мышей наблюдали в течение первых 24 часов на предмет появления каких-либо непосредственных признаков токсичности и ежедневно в течение 30 дней. Вес тела и потребление пищи и воды измеряли через день.Через 30 дней животных анестезировали тиопенталом в дозе 40 мг / кг (Тиопентакс, Кристалия, Бразилия) внутрибрюшинно (внутрибрюшинно) и подвергали эвтаназии путем смещения шейных позвонков в соответствии с Правилами CONCEA [12].

2,5. Биохимические и гематологические определения

Образцы крови были взяты путем пункции сердца и собраны без антикоагулянта для биохимических доз и с антикоагулянтом (EDTA) для общего анализа крови. Биохимические параметры, проанализированные в сыворотке крови, включали глюкозу (G), общий холестерин (TC), триглицериды (TG), аспартатаминотрансферазу (AST), аланинаминотрансферазу (ALT), мочевину (Ur), креатинин (Cr) и общий белок (TP ), выполняемый с помощью соответствующих диагностических наборов для автоматического биохимического анализатора Labmax Plenno (Labtest, Бразилия).Анализируемыми гематологическими параметрами были количество лейкоцитов (WBC) и дифференциальный подсчет лейкоцитов, тромбоцитов, гематокрит и гемоглобин (Hb), средний корпускулярный объем (MCV), средний корпускулярный гемоглобин (MCH) и средняя концентрация корпускулярного гемоглобина (MCHC). на автоматическом анализаторе ABX Micros 60-OT (Horiba ABX, Япония).

2.6. Гистопатологический анализ

Для гистопатологического анализа фрагменты собранных органов (почка, печень и селезенка) исследовали макроскопически, взвешивали и рассчитывали отношение массы органа к общей массе тела.Фрагменты были зафиксированы в 10% формальдегиде и переданы профессору Клаудии Нунес Оливейра в отделение патологии Федерального университета Риу-Гранди-ду-Норти для гистологического анализа. Их окрашивали гематоксилином и эозином, а параметры повреждения тканей исследовали на предмет наличия или отсутствия апоптоза, некроза, гидропической дегенерации, стеатоза, холестаза, пластической пролиферации, фиброза, воспалительной реакции, набухания канальцев и отека [14].

2.7. Клеточная культура

Клеточные линии из неопухолевых фибробластов мыши (3T3) и линии клеток фибробластов мышей с карциномой почек (786-0) были пожертвованы профессором Dr.Hugo Alexandre de Oliveira Rocha с кафедры биохимии Федерального университета Риу-Гранди-ду-Норти, приобретенный у Американской коллекции типовых культур (ATCC, Роквилл, Мэриленд, США). Их поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Sigma-Aldrich, Co., Германия), с добавлением 10% FBS в концентрации 2,5 × 10 4 / мл в 10 мл среды в 75 см 3 флакон для культивирования. Клетки отбирали каждые два дня с использованием 0,25% трипсина в PBS, центрифугировали и ресуспендировали в свежей культуральной среде.

2,8. Анализ жизнеспособности клеток / МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид)

Жизнеспособность клеток водно-спиртового экстракта анализировали в культурах клеток при различных концентрациях и периодах времени. Клетки высевали в 96-луночные микропланшеты при концентрации клеток на лунку. Их помещали в среду DMEM с добавлением 10% FBS для поддержания и роста клеток и выдерживали в течение 24 часов в инкубаторе при 36,5 ° C с 5% CO 2 . Впоследствии пластину лишили и оставили на 24 часа в тех же условиях.После удаления супернатанта концентрации 1, 10, 10 2 , 10 3 и 10 4 мк л / мл экстракта в среде DMEM (10% FBS) были добавлены в трех экземплярах к раствору. пластина. После 24-, 48- и 72-часовой инкубации все содержимое среды в микропланшетах было выброшено; в лунки добавляли реагент 10% МТТ (Oz Biosciences, Сан-Диего, США). Через 4 часа супернатант сливали и добавляли 100 мкл л абсолютного этанола для солюбилизации образовавшихся кристаллов.Оптическую плотность каждой лунки измеряли в Elisa Reader 570 нм [15, 16].

2.9. Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием SPSS v.20 для Windows (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). Для независимых выборок применяли дисперсионный анализ с посттестом Тьюки-Крамера. Непараметрические переменные анализировались с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Гистопатологические анализы оценивали с помощью теста Фишера. Все тесты рассчитывались с уровнем значимости 5%.

3. Результаты и обсуждение
3.1. Оценка острой и субхронической токсичности

При оценке острой токсичности биохимические параметры глюкозы, триглицеридов, АЛТ и креатинина показали значительную разницу () между группами животных (Таблица 1). В субхронической оценке параметры глюкозы, AST и креатинина показали значительную разницу () между группами (таблица 2).

904 90 106,60 ± 19,19
Параметры / группы Контроль 250 мг / кг 500 мг / кг2 904

0 99049

Мужчины
Глюкоза (мг / дл) 102,30 ± 95,39 202,00 ± 75,16 215,80 ± 56,44 190,60 ± 67, 77
Триглицериды (мг / дл) 94,11 ± 41,97 81,20 ± 20,85 78,20 ± 14,57 73,20 ± 14,24
Холестерин (мг / дл) 111,89 ± 26,54 202,60 ± 64,10 114,40 ± 45,77 116,40 ± 15,34
TP (мг / дл) 4,19 ± 0,85 2,16 ± 1,69 5,08 ± 1,57 4,64 ± 0,83
AST (U / L) 131,22 ± 56,82 90 491 148,60 ± 31,11 148,00 ± 18,55 152,40 ± 56,29
ALT (Ед / л) 56,70 ± 15,88 55, 40 ± 13,22 70,80 ± 7,60 46,80 ± 15,47
Мочевина (мг / дл) 72,56 ± 6,06 82,20 ± 12, 26 70,60 ± 8,08 76,00 ± 6,96
Креатинин (мг / дл) 0,13 ± 0,20 0,48 ± 0,33 0 , 24 ± 0,22 0,40 ± 0,00
Самки
Глюкоза (мг / дл) 144,20 ± 50,25 226, 20 ± 53,27 126,80 ± 41,14 234,60 ± 38,60
Триглицериды (мг / дл) 114,40 ± 31,09 144,60 ± 44, 50 81,40 ± 18,15 72,00 ± 8,19
Холестерин (мг / дл) 124,40 ± 11,67 75,00 ± 14,88 102,20 ± 10,85
TP (мг / дл) 2,92 ± 0,85 5,46 ± 0,55 3,76 ± 0,91 3,64 ± 0,46
АСТ (Ед / л) 151,80 ± 82,79 201,60 ± 195,69 127,40 ± 6,88 147,20 ± 57,84
АЛТ (Ед / л) 70,40 ± 2,07 53,00 ± 14,76 72, 20 ± 5,76 38,20 ± 12,05
Мочевина (мг / дл) 73,60 ± 2,07 59,00 ± 7,91 53,20 ± 7, 79 54,80 ± 11,88
Креатинин (мг / дл) 0,16 ± 0,22 0,42 ± 0,04 0,24 ± 0,22 0 , 22 ± 0,16
Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение ().AST: аспартатаминотрансфераза; АЛТ: аланинаминотрансфераза; TP: общий белок. ⁢ представление статистической разницы с контрольной группой ().
2 9049 кг
123,80 ± 20,41
Параметры / группы Контроль 250 мг / кг
Мужчины
Глюкоза (мг / дл) 56,375 ± 34,912 99,60 ± 23,787 93,00 ± 34,169 82,40 ± 22,534 9048lyce мг / дл) 109,80 ± 48,634 92,60 ± 22,974 92,20 ± 26,243 85,800 ± 38,311
Холестерин (мг / дл) 70,10 ± 25,632 64 , 40 ± 22,244 82,20 ± 35,160 80,600 ± 16,273
TP (мг / дл) 4,556 ± 1,014 4,20 ± 0,8367 4,60 ± 0,5477 4,60 ± 1,140
AST (Ед / л) 120,30 ± 40,415 122,60 ± 26,81 214,20 ± 106,00 216,80 ± 113,7
ALT (Ед / л) 52,00 ± 26,051 37,40 ± 5,459 85,20 ± 40,69 85,60 ± 69,20
Мочевина (мг / дл) 51,80 ± 9,426 45,20 ± 11,713 42,20 ± 1,789 62,40 ± 8,877
Креатинин (мг / дл) 0,508 ± 0,0702 0,548 ± 0,08402 0,600 ± 0,0 0,694 ± 0,1915
Женщины
Глюкоза (мг / дл) 64,375 ± 30,863 97,801 90,204 27,09087
Триглицериды (мг / дл) 75,875 ± 22,10 152,20 ± 20,19 151,25 ± 98,215 94,00 ± 66,142
Холестерин (мг / дл) 67,00 ± 37,74 80,40 ± 47 479 53,750 ± 17,84 64,40 ± 23,522
TP (мг / дл) 3, 50 ± 0,9718 5,00 ± 0,7071 4,60 ± 0,8944 4,60 ± 0,1342
AST (Ед / л) 159,67 ± 84,714 130,60 ± 58,188 116,00 ± 6,519 156,00 ± 99,82
АЛТ (Ед / л) 65,11 ± 58,91 39,60 ± 5,030 45,00 ± 5,244 69,20 ± 31,83
Мочевина (мг / дл) 48,30 ± 9,31 47,00 ± 6,745 43,80 ± 6,907 49 , 20 ± 12,637
Креатинин (мг / дл) 0,7355 ± 0,4784 0,5975 ± 0,0689 0,925 ± 0,0957 0,600 ± 0,00
Значения выражены как среднее ± стандартное rd отклонение ().AST: аспартатаминотрансфераза; АЛТ: аланинаминотрансфераза; TP: общий белок. ⁢ представление статистической разницы с контрольной группой ().

В тестах на гематоксичность не было статистически значимой разницы между группами; однако мужская группа при дозе 1000 мг / кг представила высокие гранулоциты по сравнению с контрольной группой (), и были различия между мужчинами и женщинами контрольных групп по гематокриту, тромбоцитам, лимфоцитам и моноцитам.

3.2. Гистопатологический анализ

Гистопатологический анализ выявил неизменные результаты у большинства животных. Стеатоз печени (EH), воспалительная реакция (RI), экстраспинальный гемопоэз (ESH), застой в печени (CH) и почечный застой (CR) не показали различий между любой из групп.

Поджелудочная железа не показала гистологических изменений ни у одного из животных при острой и субхронической оценке, а также гистопатологии почек при острой оценке.Однако при субхронической оценке клеточный инфильтрат в почках был обнаружен у женщин из групп 500 и 1000 мг / кг.

Апоптоз присутствовал в группах доз 500 мг / кг и 1000 мг / кг в остром исследовании (рис. 1). Субхроническая оценка показала умеренный стеатоз (рис. 2 (а)) и точечный ишемический некроз в группе, получавшей дозу 1000 мг / кг (рис. 2 (б)).

3.3. Оценка жизнеспособности клеток

За 24-часовой период у штамма 3T3 экстракт показал жизнеспособность клеток при концентрациях от 10 до 10 3 мк мкг / мл и снижение жизнеспособности клеток при концентрациях 1 и 10 4 μ г / мл до 80%, а также через 48 часов при концентрациях от 1 до 10 2 μ г / мл в диапазоне от 10,34 до 25,74%.Концентрации 10 3 и 10 4 мк мкг / мл показали жизнеспособность клеток 93,99%; и через 72 часа все концентрации вызывали нарушение жизнеспособности клеток в диапазоне от 10,53 до 79,81% (рис. 3).


У клеток 786-0 за 24-часовой период жизнеспособность клеток снижена при всех концентрациях, при этом 10 3 мк мкг / мл нарушены в 61,68%; через 48 часов также наблюдалось снижение жизнеспособности клеток на 89,65% и 72,57% в концентрациях 10 3 и 10 4 мк г / мл соответственно, а также через 72 часа , в концентрациях 10 2 , 10 3 и 10 4 мк мкг / мл, и было нарушение жизнеспособности клеток на 91,59%, 92,26% и 84,44%. соответственно (рисунок 4).


Масса тела является одним из параметров, наиболее часто используемых в токсикологических оценках для индикации появления токсических эффектов определенного вещества в организме животного, а также снижения потребления воды и корма, изменения поведения, апатии и плохое состояние волос. Отсутствие этих сигналов между группами животных предполагает, что экстракт не проявляет токсичности в этих условиях. Литературные исследования подтверждают эти результаты [17, 18].

Биохимические параметры метаболически отражают физиологический статус животных, участвующих в исследовании токсичности. На уровень глюкозы может влиять несколько факторов, таких как диета и кишечная абсорбция [19]. Изменения, обнаруженные в глюкозе для острой оценки (доза 250 мг / кг) и субхронической оценки (самки доза 1000 мг / кг) не определяют развитие диабета у животных, поскольку может существовать конкуренция переносчика глюкозы с гликозилированным кверцетином. , влияющие на концентрацию глюкозы в сыворотке крови или даже стресс, от которого страдает животное [20].Кемпферол, также содержащийся в экстракте, стимулирует поглощение глюкозы клетками нормальных животных, но этим флавоноидам необходимо присутствие сахаров, связанных с функциональным ядром флавоноидов, чтобы инициировать их инсулиномиметическое действие [21, 22].

Однако часть сахара, связанная с флавоноидами, увеличивает полярность молекулы и вызывает стерические препятствия для связывания с белками-носителями в кровотоке; таким образом, более гликозилированная часть является свободной, отвечая за увеличение концентрации глюкозы при оценке токсичности.Кроме того, первоначальная перегрузка, которую могла испытать печень при метаболизме экстракта, могла повлиять на концентрацию глюкозы. И эта перегрузка больше не ощущается при субхронической оценке [23].

Возможное объяснение расхождений между результатами этого исследования и литературой может быть связано с выбором пути введения, дозы, типа экстракта и вида животных, на которых тестировались экстракты.

При острой и субхронической оценке профили триглицеридов были схожими, с меньшими средними триглицеридами при увеличении дозы, с разницей в острой оценке (доза 1000 мг / кг) и субхронической оценке (женская доза 250 мг / кг).Предполагается, что экстракт проявляет активность в отношении триглицеридов, но механизм действия не может быть описан; только предполагается, что за активность отвечает ингибирующее действие ферментов этого метаболизма или повышение антиоксидантной активности флавоноидов, присутствующих в этом растительном экстракте [24].

Общий холестерин не отличался между группами. Исследования растений с гипохолестеринемическим действием коррелируют этот эффект с ингибированием ферментов, участвующих в метаболизме липидов действием, в основном флавоноидов, которые действуют с антиоксидантным эффектом за счет снижения липопероксидации и повышения активности антиоксидантных ферментов [25, 26].

Ферменты печени аспартатаминотрансфераза (AST) и аланинаминотрансфераза (ALT) оценивали повреждение печени. Более высокая активность АЛТ в группах доз 500 и 1000 мг / кг у женщин и 500 мг / кг у мужчин в остром анализе указывает на повреждение печени, подчеркивая острую токсичность в этих дозах [24, 26, 27]. Самки более восприимчивы к изменениям, что можно лучше понять с помощью гистопатологических данных. Изменение AST (мужская доза 1000 мг / кг) при субхронической оценке предполагает, что экстракт вызвал более глубокое поражение органа, что визуализировалось при гистопатологическом анализе.

Общий белок, синтезируемый печенью, отражает функциональную способность печени, которая не проявляет гепатоцеллюлярный токсический эффект при данной дозировке. Дозы AST, ALT и общих белков демонстрируют печеночный профиль, оцениваемый по поражению и функции, и можно утверждать, что экстракт K. brasiliensis не способствует серьезным нарушениям функции печени, поскольку функция синтеза органа остается неизменным, а изменение фермента ALT в печени показывает, что повреждение может быть обратимым [24, 27].Функция почек, проанализированная с помощью дозировок мочевины и креатинина, не показала изменений, соответствующих токсичности при острой и субхронической оценке. Однако при острой оценке (доза для женщин 1000 мг / кг) и субхронической оценке (доза для женщин 500 мг / кг) наблюдались некоторые различия в содержании мочевины, которые могут быть связаны с гистологическими данными, и поэтому предполагается, что экстракт действительно не вызывать повреждения почек из-за наличия защитных соединений, таких как кверцетин, обеспечивая безопасность экстракта.

С другой стороны, креатинин (доза для женщин 1000 мг / кг) имел различие и, возможно, происходило из-за действия женских гормонов или мышечной массы, меньшей, чем у мужчин, и его эффект не был связан с экстрактом.

Также предполагается, что изменения гематологических параметров не связаны с эффектами, вызванными экстрактом, поскольку они являются ожидаемыми изменениями для вида [28, 29]. Некоторые исследования показали, что острый индуцированный стресс у животных вызывает выброс катехоламинов и набор лейкоцитов, которые вызывают увеличение количества клеток в кровообращении, что наблюдалось при оценке субхронической токсичности в самой высокой дозе экстракта [30].

В гистопатологии обнаружение клеточной инфильтрации в почках при субхронической оценке, характерной для воспаления, имеет восходящий и тазовый характер, и, следовательно, это не связано с экстрактом, поскольку изменение происходит у женщин, которые больше восприимчивы к инфекциям мочевыводящих путей [31]. Острый апоптоз (дозы 500 и 1000 мг / кг) (рисунок 1) заслуживает внимания для этих доз, а также наличие точечного ишемического некроза (рисунок 2 (b)) при субхронической оценке (доза 1000 мг / кг). ), предполагая, что этот эффект повреждения клеток приписывается экстракту.

Исследования подтверждают безопасность экстракта благодаря поддержанию гистологической целостности почек, приписывая этот эффект кверцетину [20, 32]. Что касается гистологии печени, предполагается, что экстракт вызывал острые и легкие гепатоцеллюлярные повреждения, что подтверждается найденными биохимическими данными [19, 24, 25, 32].

Необходимо найти новые вещества, способные различать их действие на нормальные и раковые клетки. Это необходимый критерий для избирательного уничтожения раковых клеток, и селективные натуральные продукты стали крайне необходимыми [33].В этом исследовании при оценке жизнеспособности клеток нормальные клетки (3T3) не были повреждены экстрактом, тогда как для линии 786-0 наблюдалось значительное нарушение. Эти результаты подчеркивают важность углубленных исследований этого вида с многообещающей терапевтической активностью.

Предыдущая работа [2, 3] в нашей группе сообщала о присутствии гликозилированных флавоноидов с агликонами, происходящими в основном из патулетина и эупафолина. Согласно этим результатам, можно предположить, что флавоноиды могут иметь активность К.brasiliensis в клетках 786-0, так как они действуют в контроле свободнорадикального патогенеза за счет восстановления алкилпероксильных радикалов (ROO — ) [34]. Исследования показали, что фенольные соединения могут действовать в профилактике рака, а также в ингибировании дифференцировки клеточного цикла, вызывая апоптоз [34–36]. Прооксидантный эффект кверцетина также может быть ответственным за цитотоксические и проапоптотические эффекты [20]. Более того, исследования Berger et al. (2013) показывают, что кемпферол действует на ингибирование гистоновых деацетилаз, которые связаны с развитием новообразований, предполагая, что экстракт является многообещающим для разработки противоопухолевых препаратов [37].

Одним из ограничений настоящего исследования является то, что токсичность ни одной из фракций этого экстракта еще не исследована, а также то, что животные очень чувствительны к стрессу, и это может отражаться на наблюдаемых параметрах. Однако этот недостаток не исключает результатов, полученных в данной работе.

4. Выводы

Экстракт листьев Kalanchoe brasiliensis снижал жизнеспособность клеток в клеточной линии 786-0, особенно в более высоких дозах с аналогичным профилем клеточного ингибирования во все наблюдаемые периоды времени.Это исследование также продемонстрировало, что экстракт in vivo обладает низким острым токсическим действием , наиболее очевидным при дозе 1000 мг / кг, наблюдаемым в концентрациях ALT и гистопатологии печени. Что касается субхронической токсичности, на основании гистологических данных сделан вывод о низкой относительной токсичности. Экстракт листьев Kalanchoe brasiliensis представляет собой многообещающий объект исследования для разработки лекарственных средств растительного происхождения. Однако по-прежнему необходимы дальнейшие исследования его токсичности, чтобы гарантировать его безопасность.

Раскрытие информации

Это исследование не получало какого-либо специального гранта от финансирующих агентств в государственном, коммерческом или некоммерческом секторах.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Выражение признательности

Авторы благодарны всей команде Laboratório de Pesquisa em Bioquímica Clínica e Experimental, Лаборатории фармакогнозии, Отделению биохимии UFRN и профессору Claudia из отделения патологии UFRN.

Неочищенный экстракт из листьев Libidibia ferrea (Mart. Ex. Tul.) L.P. Queiroz уменьшал внутрисуставное воспаление, вызванное зимозаном у крыс | BMC Дополнительная медицина и терапия

Растительный материал

Растительный материал, состоящий из листьев Libidibia ferrea (Март. Ex. Tul.) LP Queiroz, был собран в биоме Каатинга в городе Ресифи, Пернамбуку, Бразилия (8o3 ’30 ” S 34o54 ’12 ”з.д.) в сентябре 2014 г. После сбора сушили в сушильном шкафу с циркуляцией воздуха (при 45 ° C в течение 7 дней).Материал был идентифицирован доктором Ритой де Касиа Перейра, а затем ваучерный образец был депонирован в гербарии Агрономического института Пернамбуко (Instituto Agronômico de Pernambuco — IPA) под номером 89419.

Получение неочищенного водного экстракта

Libidibia ferrea ( Mart. Ex. Tul.) LP Queiroz leaves (LfAE)

Неочищенный экстракт Libidibia ferrea (Mart. Ex. Tul.) LP Queiroz листья были получены с 10% ( w / v ) путем турбо экстракции (четыре циклы экстракции по 30 с, с перерывом в 5 мин) с использованием воды в качестве растворителя [12].Неочищенный водный экстракт Libidibia ferrea (Mart. Ex. Tul.) Листья L.P. Queiroz (LfAE) замораживали при -80 ° C в течение трех дней, а затем лиофилизировали (Модель L101, Liotop ® ). Количественное определение эллаговой кислоты и галловой кислоты проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в соответствии с методологией, ранее описанной De Araújo et al. [9] и Guerra et al. [12] с адаптацией на общее время (31 мин).

Животные

Самцы крыс линии Wistar ( Rattus norvegicus albinus , 150–250 г) были получены из лаборатории Федерального университета Риу-Гранди-ду-Норти, кафедра биофизики и фармакологии.Животных содержали в помещении с контролируемой температурой 23 ° C ± 2 ° C в 12-часовом цикле свет-темнота с доступом к пище и воде ad libitum. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму количество используемых животных и любой возможный дискомфорт для них. Управление использованием животных соответствовало принципам и руководствам, утвержденным Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, в то время как эвтаназия соответствовала Практическим рекомендациям CONCEA по эвтаназии. Используемые протоколы были ранее одобрены Комитетом по этике использования животных (CEUA) посредством заключения 01/2015.

Модель артрита, индуцированного зимозаном

Метод был выполнен, как описано Chaves et al. [13]. Животные были разделены на шесть групп по шесть животных в каждой: нормальный контроль (без зимозана и обработанный физиологическим раствором 0,9%), зимозан контроль (с зимозаном и обработанный физиологическим раствором 0,9%), стандартный (диклофенак 100 мг / кг) и LfAE (с зимозан, обработанный LfAE 100, 200 и 300 мг / кг). За час до индукции артрита животных лечили физиологическим раствором, диклофенаком или LfAE.Индукцию артрита проводили внутрисуставной инъекцией 1 мг зимозана, растворенного в 50 мкл 0,9% физиологического раствора, в коленный сустав крысы. Во всех группах наблюдалась индукция внутрисуставного воспаления, за исключением нормального контроля, которым вводили только 50 мкл 0,9% внутрисуставного физиологического раствора. Через 24 ч животных подвергали внутрибрюшинной эвтаназии летальной дозой тиопентала (90 мг / кг), связанной с лидокаином (10 мг / мл). Синовиальную жидкость собирали для анализа клеточного притока, определения активности миелопероксидазы (МПО), глутатиона, малонового диальдегида (МДА) и воспалительных цитокинов.Синовиальную оболочку удалили для гистопатологического анализа.

Результаты экспериментов

Во время эксперимента регистрировали поведение и гибель животных.

Анализ клеточного притока

Сбор синовиальной жидкости выполняли для всех групп путем промывания полости сустава натрий-фосфатным буферным раствором (0,15 M PBS, pH 7,4) в 0,01 M EDTA. Объем 0,2 мл буфера в суставе и аспирированный объем помещали в пробирку Эппендорфа.Промывные образцы использовали для общего подсчета лейкоцитов в камере Нойбауэра, разбавленной раствором индейки в соотношении 1:20.

Определение активности миелопероксидазы

Определение активности фермента МПО производилось в соответствии с процедурой, выполненной Krawisz, Sharon и Stenson [14]. Этот анализ основан на моющем действии 0,5% буфера гексадецилтриметиламмония бромида (HTAB) в 0,05 M физиологическом фосфатном буфере — pH 6,0 (PBS), который способствует высвобождению MPO из гранул в нейтрофилы.Реакция этого фермента с хромогенным реагентом, состоящим из о-дианизидин дигидрохлорида (0,167 мг / мл) в 0,05 М буфере PBS-pH 6,0 с 0,0005% перекисью водорода w / v , образует хромофор, который абсорбируется при 450 нм. .

Промывка стыков, предназначенная для анализа, была предварительно кондиционирована в пробирке Эппендорфа, а затем заморожена при -80 ° C. Затем образец разморозили для начала анализа. Количество HTAB для каждого образца рассчитывали из соотношения 1:20 v / v с помощью кондиционированного объема промывки суставов.Затем 20 мкл суставного лаважа добавляли к 400 мкл HTAB во всех образцах, которые гомогенизировали в течение примерно 10 с путем встряхивания, переносили в морозильную камеру и подвергали трехкратному замораживанию-оттаиванию в течение 1 дня. После последнего оттаивания промывку центрифугировали при 7000 G в течение 10 мин при температуре 4 ° C. Затем на планшете для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) 50 мкл стандартного разведения пероксидазы добавляли к калибровочной кривой, 50 мкл буфера HTAB к холостым пробам и 50 мкл супернатанта пробы, все в дубликатах.В каждую лунку добавляли 150 мкл хромогенного реагента и затем измеряли оптическую плотность при 450 нм с помощью спектроскопического УФ / видимого анализа (Biotek®, Сан-Паулу, Бразилия) при 0 и 3 мин при 37 ° C. Ферментативную активность МПО рассчитывали путем интерполяции результатов поглощения на стандартной кривой, построенной с ферментом нейтрофилов человека и пероксидазой хрена. Результаты были выражены как U / суставная жидкость.

Определение общего содержания глутатиона

Определение общего содержания глутатиона проводили по методу, описанному Андерсоном [15].Промывка для стыков, предназначенная для анализа, была предварительно кондиционирована в пробирке Эппендорфа, а затем заморожена при -80 ° C с объемом трихлоруксусной кислоты (TCA 5% w / v в дистиллированной воде) в соотношении 1:20 v. / v, чтобы избежать деградации GSH гамма-глутамилтранспептидазой. Затем 20 мкл образца использовали для 400 мкл TCA. Для определения этого содержания образцы оттаивали и помещали в автоматический гомогенизатор примерно на 2 мин на холоду. Затем образцы центрифугировали при 2000 G в течение 5 мин при 4 ° C.Затем 100 мкл образца отбирали в пробирку Эппендорфа, затем добавляли 100 мкл водного раствора фосфата натрия и ЭДТА (143 мМ PBS-EDTA-PBS и 6,3 мМ EDTA, pH 7,5) вместе с 700 мкл раствора. раствор НАДФН (0,289 мМ β-НАДФН в PBS-EDTA) и 100 мкл раствора DTNB (6 мМ DTNB в PBS-EDTA). Растворы переносили на водяную баню на 5 мин при 30 ° C, затем переносили в лунки планшета для ELISA и добавляли 25 мкл раствора фермента (глутатионредуктазы в PBS-EDTA 266 МЕ / мл) в каждую лунку.Оптическую плотность определяли при длине волны 412 нм с помощью спектроскопического анализа UV / VIS (Biotek®, Сан-Паулу, Бразилия) через 0 и 3 мин. Общее содержание глутатиона рассчитывали путем интерполяции стандартной кривой, и результаты выражали в нмоль / мл.

Определение содержания малонового диальдегида

Определение содержания МДА проводили, как описано ранее [16]. Промывка для стыков, предназначенная для анализа, была предварительно кондиционирована в пробирке Эппендорфа и заморожена при -80 ° C.Для анализа образцы оттаивали и разбавляли 20 мМ буфером Tris HCl-pH 7,4 в соотношении 1: 5 v / v, и использовали 20 мкл образца и 100 мкл буфера. Образцы помещали в автоматический гомогенизатор примерно на 15 с, а затем отправляли на центрифугирование при 2500 G в течение 10 мин при 4 ° C. 100 мкл образца, 250 мкл хромогенного реагента (1-метил-2-фенилиндол 10,3 мМ в ацетонитриле 3: 1) и 75 мкл 37% соляной кислоты (HCL) помещали в другую пробирку Эппендорфа, которую инкубировали в водяная баня при 45 ° C в течение 40 мин.Затем образцы отбирали для центрифугирования в течение 5 минут при 2500 G и переносили в лунки планшета для ELISA. Оптическую плотность определяли при длине волны 586 нм с помощью спектроскопического УФ / видимого анализа (Biotek®, Сан-Паулу, Бразилия). Содержание MDA рассчитывали путем интерполяции стандартной кривой, и результаты выражали в нмоль / мл.

Уровни воспалительных цитокинов IL-1β и TNF-α

Образцы синовиальной оболочки хранили при -70 ° C до тех пор, пока они не потребуются для каждого анализа. Жидкость синовиальной оболочки гомогенизировали и обрабатывали, как описано Safieh-Garabedian et al.[17]. Уровни IL-1β (диапазон обнаружения: 62,5–4000 пг / мл; чувствительность или нижний предел обнаружения: 12,5 нг / мл рекомбинантного мышиного IL-1β) и TNF-α (диапазон обнаружения: 62,5–4000 пг / мл; чувствительность или нижний предел обнаружения: 50 нг / мл рекомбинантного мышиного TNF-α) в образцах синовиальной оболочки определяли с помощью коммерческого набора для ELISA (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, USA ). Все образцы были в пределах длины волны, используемой для спектрофотометрии в УФ-видимой области спектра, измеренной при 490 нм (Biotek®, Сан-Паулу, Бразилия).

Гистопатологический анализ

Синовиальную мембрану собирали и фиксировали в 10% формальдегиде, после чего процедуры проводили обычными методами до включения в парафиновые блоки. Обезвоживание и другие этапы лечения, направленные на извлечение воды из тканей путем погружения их в ванны с возрастающей концентрацией от 70% этанола до абсолютного этанола. Этот растворитель был заменен ксилолом, что сделало ткани полупрозрачными. Наконец, были добавлены фрагменты, залитые парафином.Срезы тканей помещали в прямоугольные формы, формируя блоки, которые затем разрезали стальными ножами микротома толщиной 4 мкм для окрашивания гематоксилин-эозином [18]. Гистологическую оценку проводили путем присвоения следующих баллов [19]: 0 — инфильтрат и отек воспалительных клеток отсутствуют, отсутствуют гигантские клетки и гранулема, области фиброза, неоваскуляризации, некроза и кровотечения; 1 — дискретный воспалительный клеточный инфильтрат и отек, редкие гигантские клетки и гранулема с участками фиброза, неоваскуляризации и дискретных кровоизлияний; 2 — Интенсивный воспалительный клеточный инфильтрат и отек, наличие гигантских клеток и гранулемы с участками фиброза, неоваскуляризации, некроза и обширных кровоизлияний; 3 — Интенсивный воспалительный клеточный инфильтрат и отек, наличие большого количества гигантских клеток и гранулемы с большими участками фиброза, неоваскуляризации, некроза и кровоизлияния.Анализы проводил опытный патолог, не знающий протокола лечения.

Статистический анализ

Все экспериментальные данные были нанесены на график как среднее ± стандартное отклонение (SD). Результаты были статистически оценены с помощью дисперсионного анализа (односторонний дисперсионный анализ) и апостериорного критерия Тьюки-Крамера. Для сравнения медиан в гистопатологическом анализе использовались тест Краскела-Уоллиса и пост-тест Данна. Уровень статистической значимости составил p <0.05. Анализ результатов и построение графиков проводились с помощью GraphPad Prism версии 5.04.

Оценка токсичности in vivo и in vitro гидроэтанольного экстракта листьев Kalanchoe brasiliensis (Crassulaceae).

Страница / Ссылка:

URL страницы: HTML-ссылка: 7 преимуществ кокосовой воды для здоровья

Кокосовая вода, известная своей концентрацией электролитов, витаминов и минералов, охватила всю страну.От студий йоги до торговых автоматов, вы можете купить тропический напиток где угодно.

Кокосовая вода производится из прозрачной жидкости внутри зеленых кокосов. Его не следует путать с кокосовым молоком, которое производится из воды и мякоти зрелого кокоса. Более 95 процентов кокосовой воды - это вода.

Несмотря на недавний взрыв популярности, кокосовая вода веками потреблялась в тропических регионах по всему миру. В традиционной аюрведической медицине считается, что кокосовая вода помогает пищеварению, мочеиспусканию и даже выработке спермы.Его также традиционно использовали для лечения обезвоживания и дарили в тропиках в качестве церемониальных подарков. Хотя это не может быть чудодейственным лекарством, у него есть много преимуществ для здоровья.

Натуральные электролиты кокосовой воды делают ее отличным дополнением к традиционным спортивным напиткам, таким как Gatorade. Сделанный без добавления сахара, пищевых красителей или искусственных подсластителей, многие люди предпочитают кокосовую воду как более натуральный напиток.

Исследования показали, что кокосовая вода полезна не хуже, чем традиционный спортивный напиток, поддерживая гидратацию и восполняя жидкость после пробежки.Однако в кокосовой воде меньше натрия, основного электролита, который вы теряете с потом, чем в большинстве спортивных напитков. В нем также меньше углеводов, чем во многих напитках, предназначенных для повышения выносливости. Это означает, что он может не дать вам достаточно энергии для длительной тренировки (более 90 минут), но после этого поможет вам восстановить водный баланс.

Хотя кокосовая вода не помогает регидратации лучше, чем вода или традиционные спортивные напитки после тренировки, исследование показало, что было легче выпить достаточное количество жидкости, не вызывая тошноты или расстройства желудка.Исследователи также рекомендуют избегать кокосовой воды с добавлением сахара, потому что они препятствуют правильному увлажнению и добавляют ненужные калории.

По данным Академии питания и диетологии, кокосовая вода, содержащая всего 45 калорий в чашке, является отличной заменой более калорийным напиткам, таким как газированные напитки или сок. В кокосовой воде меньше сахара и углеводов, чем в большинстве соков. Он также содержит больше минералов и электролитов, таких как натрий и калий. Тем не менее, при обычном потягивании она все равно не может конкурировать с водой с нулевой калорийностью.

Кокосовая вода содержит в 10 раз больше калия, чем большинство спортивных напитков. Стакан кокосовой воды на 8 унций содержит столько же калия, сколько банан. Большинство американцев не соблюдают ежедневные рекомендации по содержанию калия. При содержании 405 мг на чашку калия в кокосовой воде можно избавиться от судорог.

Калий помогает поддерживать баланс жидкости и электролитов в организме, особенно во время упражнений. Поскольку в кокосовой воде больше калия, чем натрия, калий может помочь сбалансировать влияние натрия на кровяное давление и, возможно, даже помочь снизить его.

Кальций необходим не только для крепких костей и зубов. Это помогает мышцам сокращаться и работать должным образом. Во время тренировки ваши мышцы натягивают кости и слегка их ломают. Когда ваше тело восстанавливается, ваши кости используют кальций для укрепления и восстановления.

Магний помогает перемещать кальций и калий в мышцы, что способствует сокращению и расслаблению. Он также помогает с выработкой энергии и поддерживает функции органов. Тяжелая тренировка может привести к истощению запасов магния и склонности к судорогам, беспокойным мышцам и спазмам.

Хотя кокосовая вода содержит больше кальция и магния, чем другие спортивные напитки или фруктовые соки, она не является концентрированным источником ни одного минерала. Кокосовая вода содержит менее 5 процентов рекомендуемого количества кальция и магния.

Помимо всех своих увлажняющих свойств, кокосовая вода содержит антиоксиданты, которые помогают нейтрализовать окислительный стресс и свободные радикалы, создаваемые упражнениями. Ищите свежую кокосовую воду, чтобы получить максимальное количество антиоксидантов.Согласно недавнему исследованию, обработанная и нагретая пастеризованная кокосовая вода содержит меньше антиоксидантов.

Аминокислоты необходимы для восстановления тканей и являются строительными блоками белка. Кокосовая вода содержит больше аланина, аргинина, цистеина и серина, чем коровье молоко. Это основной источник аргинина, аминокислоты, которая помогает вашему организму реагировать на стресс (например, стресс, вызванный тяжелой тренировкой). Аргинин также может помочь сохранить здоровье сердца.

Гормоны, которые помогают растениям расти, также известные как цитокинины, также содержатся в кокосовой воде.Считается, что эти соединения обладают антивозрастными и противораковыми свойствами. Однако на сегодняшний день никакие крупные исследования не показали, что кокосовая вода защищает от рака.

Суть в том, что кокосовая вода может быть отличным способом восстановить водный баланс после тяжелой, потной тренировки. Замени кокосовую воду традиционным спортивным напитком и не добавляй сахар, красители и другие синтетические ингредиенты.

Если вы пытаетесь похудеть, лучше вместо этого выбрать воду. Академия питания и диетологии также рекомендует выбирать воду, если вы не сильно потеете, так как кокосовая вода не увлажняет вас лучше, чем вода, а также содержит дополнительные калории и сахар.

Поищите свежую необработанную кокосовую воду, чтобы получить максимальное количество антиоксидантов и ощутить истинный вкус тропиков.

Обработка бурового шлама микроэмульсией

Материалы

Загрязненный буровой шлам, собранный в сланцевом шейкере, и n -парафин (используемый в буровых растворах) были поставлены Petrobras SA. Реагенты, использованные в экспериментах, предоставлены Synth ® , были n -бутанол, безводный Na 2 SO 4 и n -гексан.Использовали два класса неионных поверхностно-активных веществ: Алконат ® и Ultranex ® . Были протестированы шесть поверхностно-активных веществ: Alkonat ® L60 (HLB = 11,5), Alkonat ® L90 (HLB = 13,4), Alkonat ® L230 (HLB = 16,9), Ultranex ® NP 95 (HLB = 13), Ultranex ® NP 110 (HLB = 13,7) и Ultranex ® NP 230 (HLB = 16,4). Эти поверхностно-активные вещества были поставлены Oxiteno ® . Алконат ® имеет линейную цепь, а Ultranex ® ароматическую.Выбор этих поверхностно-активных веществ был основан на значении HLB (гидрофильно-липофильный баланс), т. Е. На поверхностно-активных веществах, способных эмульгировать масло в воде (значения HLB от 8 до 16), и на образовании микроэмульсии на богатой водой стороне псевдотернарная фазовая диаграмма.

Методы

Получение искусственного бурового шлама

Загрязненный буровой шлам сушили при 150 ° C в течение 4 часов. После сушки они были загрязнены парафином n в соотношении 1:10. Сухие и загрязненные стружки хранили в холодильнике не менее 48 часов, чтобы гарантировать адсорбцию парафина n на стружках.Образцы шлама, представленные для этой процедуры, были названы «искусственными шламами».

Образцы загрязненного и искусственного шлама были подвергнуты термогравиметрическому анализу (ТГА) на оборудовании Netzsch ® TG 209 F1 Libra ® . Целью анализа ТГА было сравнение образцов и проверка того, были ли используемые условия сушки (150 ° C в течение 4 часов) удовлетворительными.

Методика количественного определения
n -парафина в буровом шламе

Методология ультразвуковой экстракции, адаптированная из EPA 3550c, использовалась для определения количества n -парафина как в моделированном, так и в обработанном шламе, а затем , чтобы определить процент извлечения (US EPA 2007).

По этой методике 25 г бурового шлама смешивали с 50 мл n -гексана и помещали в ультразвуковую ванну (Elma ® Transsonic 460) на 15 мин. По истечении этого времени смесь разделяли и образец экстракта центрифугировали в пробирке при 2000 об / мин в течение 4 мин. После центрифугирования образец фильтровали в присутствии безводного Na 2 SO 4 . Экстракт, полученный на этом этапе, подвергали газохроматографическому анализу с пламенно-ионизационным детектором (GC-FID), оборудованием Thermo Scientific ® Trace 1300, колонкой Agilent Technologies ® DB-5 мс, вводимый объем 2 мкл, газ-носитель. расход (N 2 ) 2.5 мл / мин, температуры инжектора и детектора 220 и 340 ° C соответственно.

Влияние растворителя (MES)

Микроэмульсионные системы были основаны на точке Winsor IV (область микроэмульсии) на псевдотерминальной диаграмме, показанной на рис. был использован метод сложения. Различные количества активного вещества ( n -бутанол и использованное поверхностно-активное вещество при постоянном соотношении C / S = 0.5) и n -гексан залили в центрифужную пробирку объемом 10 мл при комнатной температуре (27 ° C). Затем добавляли воду (WS) и перемешивали, чтобы получить критические точки, в которых система превратилась из прозрачной в мутную. Затем систему центрифугировали в течение 5 мин (2000 об / мин) для проверки разделения фаз и затем взвешивали. Процедуру повторяли с семью смесями (2 г) с различным соотношением активного вещества + n -гексановая фаза. Таким образом, диаграмма псевдотерминальной фазы была построена путем нанесения количества воды, масляной фазы и фазы вспомогательного поверхностно-активного вещества / поверхностно-активного вещества, использованных в каждом эксперименте.Был использован MES, состоящий из водоснабжения (WS) = 83%, n -бутанол / поверхностно-активное вещество (C / S = 0,5) = 16% и n -гексан = 1%. Эта точка была выбрана таким образом, чтобы возникла микроэмульсия с использованием каждого исследуемого поверхностно-активного вещества, без необходимости показывать все шесть полученных псевдотерминальных диаграмм. Были изучены шесть неионных поверхностно-активных веществ, три из которых были этоксилированными лауриловыми спиртами (Alkonat ® L60, L90 и L230), а остальные были этоксилированными нонилфенолами (Ultranex ® NP 95, NP 110 и NP 230).

Рис. 2

Псевдотретичная фазовая диаграмма с областью микроэмульсии для базовой системы

После образования шести систем микроэмульсии были выполнены моделированные экстракции резанием. В этом исследовании использовали 25 г искусственного шлама с 25 г микроэмульсии (соотношение микроэмульсия / шлам = 1,0). Время контакта составляло 10 мин, и использовалась простая экстракция без перемешивания. После обработки смеси разделяли. Очищенные (обработанные обрезки и оставшаяся микроэмульсия) были подвергнуты ультразвуковой экстракции для определения содержания n -парафина после экстракции с помощью MES.

Экстракции для определения наилучшего MES проводили в трех экземплярах. Процент экстракции был определен путем сравнения площадей полученных хроматограмм для смоделированного шлама и шлама после обработки, используя уравнение. (1).

$$ \% _ {\ text {извлечение}} = \ left ({A _ {{{\ text {simulated}}. C}} - A _ {{{\ text {treatment}} .c}} / A_ {{{\ text {simulated}}. c}}} \ right) \ cdot 100 $$

(1)

, где A смоделировано.c - площадь хроматограммы, полученной для имитированных проб шлама, подвергнутых ультразвуковой экстракции; A treatment.c - это область хроматограммы, полученная из вырезанных образцов, обработанных MES и подвергнутых ультразвуковой экстракции.

Влияние соотношения MES / шлам

Изучение соотношения MES / шлам было основано на лучшей микроэмульсионной системе, определенной по методике, цитированной ранее. Соотношения, выбранные в этом исследовании, были равны 0.25, 0,5, 1,0, 1,5 и 2,0 (масса / масса).

Используемая методика заключается в обработке 25 г искусственного шлама с использованием наилучшего результата MES из изученных соотношений. Эксперименты проводили в трех повторностях, смеси подвергали простой контактной экстракции без перемешивания и времени контакта 10 мин. После обработки и разделения экстрагированных и очищенных смесей последняя была подвергнута ультразвуковой экстракции.

Процент извлечения также был найден с помощью уравнения.(1), анализируя результаты хроматограмм обработанных образцов при каждом изучаемом соотношении.

Влияние скорости перемешивания

Для исследования влияния скорости перемешивания использовалась водяная баня Дубнова (Tecnal ® TE-053) с горизонтальной перемешивающей платформой, на которой измерялось количество циклов перемешивания. (штрихи - штрихи). В исследовании изучали, сколько раз в минуту Эрленмейер будет выходить и возвращаться в исходное положение после горизонтального движения. Исследуемые скорости перемешивания составляли 48, 84 и 132 ступени.

Экспериментальная методика аналогична методике, использованной в предыдущих исследованиях. Здесь 25 г смоделированного шлама были смешаны с лучшим MES в наилучшем соотношении MES / шлам, с временем контакта 10 минут, с использованием простой экстракции и при указанных скоростях перемешивания. После экстракции экстрагированная смесь отделялась от очищенной и очищенная подвергалась ультразвуковой экстракции. Используя данные хроматографии, собранные как для смоделированного, так и для обработанного шлама при каждой исследованной скорости перемешивания, можно было определить полученный процент экстракции по формуле.(1).

Влияние времени контакта

Во всех проведенных до сих пор исследованиях использовалось время контакта 10 мин. Также было изучено влияние времени экстракции на процент экстракции. Время контакта, исследованное в этом эксперименте, составляло 1, 10, 20, 40, 80 и 160 мин.

Для этого исследования 25 г искусственного шлама были смешаны с лучшим MES в наилучшем найденном соотношении MSE / шлам. Смесь подвергали простой экстракции, используя найденную идеальную скорость перемешивания и варьируя время контакта.После обработки образцы были разделены, и очищенный образец был подвергнут ультразвуковой экстракции.

Используя площади хроматограмм смоделированных и обработанных проб шлама, можно было определить процентное содержание n -парафина, экстрагированного за каждый период экстракции.

Повторное использование MES

Чтобы уменьшить количество используемого MES, исследование повторного использования MES было проведено в трех последовательных экстракциях, без содействия лечению использованного MES. На рисунке 3 показана иллюстративная схема проведения исследования.

Рис. 3

Иллюстративная схема исследования повторного использования MES

В этом исследовании 50 г смоделированного шлама были смешаны с лучшим MES, определенным ранее. Этот образец MES был назван неиспользованной микроэмульсией. Другие параметры экстракции, соотношение MES / шлам, скорость перемешивания и время контакта были оптимизированы и определены ранее.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *