Ст 330 ч 1 ук: ГАС РФ «Правосудие» - ошибка 404 - Агентство недвижимости БазЭл

Содержание

задержаны пособники побега заключенных из ИВС в Подмосковье

СК: задержаны пособники побега заключенных из ИВС в Подмосковье

НОВОСТИ ЧАСА

Авторские новостиГруппа «Слот»Специально для НСНГлавные новости уходящего дня

00:00

НСН

в эфире трёх радиостанций

Станция «Наше радио» 101,7 FM

НСН

в эфире трёх радиостанций

Станция Jazz FM 89,1 FM

НСН

в эфире трёх радиостанций

Станция Rock FM 95,2 FM

СК: задержаны пособники побега заключенных из ИВС в Подмосковье

13 августа 202111:42

Редакция НСН

Задержаны двое пособников побега пятерых заключенных из изолятора временного содержания (ИВС) в подмосковной Истре. Об этом сообщила представитель Главного следственного управления СК по Московской области Ольга Врадий.

По ее словам, это местные жители, против них возбуждено уголовное дело (ч. 5 ст. 33, ч. 2 ст. 313 УК РФ).

Накануне сообщалось, что полиция Московской области задержала третьего участника побега из ИВС в Истре. Он сдался полиции и доставлен в следственный отдел. Организатор побега Александр Мавриди и еще один заключенный пока остаются на свободе, их розыск продолжается.

ФОТО: pixabay.com

Получайте свежие материалы на почту

Мы будем регулярно отправлять вам актуальные эксклюзивы и новости! Отписка доступна в письме

комментарии

Следите за новостями в социальных сетях

Получайте свежие материалы на почту

Информационное агентство «Национальная Служба Новостей (НСН)»: свидетельство о регистрации СМИ ИА № ФС77-53714 выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор) 17 апреля 2013 года.

К сожалению, браузер, которым вы пользуйтесь, устарел и не позволяет корректно отображать сайт. Пожалуйста, установите любой из современных браузеров, например:

Google Chrome Firefox Safari

Завершено расследование уголовного дела в отношении бывших прокурорских работников из Новосибирска

Главным следственным управлением Следственного комитета Российской Федерации завершено расследование уголовного дела в отношении бывшего прокурора города Новосибирска Дениса Ференца, бывшего начальника управления прокуратуры Новосибирской области Александры Авериной, а также Дмитрия Куклина, Михаила Федосеева и Павла Кулибанова.В зависимости от роли каждого они обвиняются в совершении преступлений, предусмотренных ч. 1 ст. 286, ч. 3 ст. 294, ч. 5 ст. 33, ч. 3 ст. 306, ч. 2 ст. 307, ч. 5 ст. 33, ч. 2 ст. 307 УК РФ (превышение должностных полномочий; воспрепятствование производству предварительного следствия; совершение заведомо ложного доноса о мошенничестве; дача заведомо ложных показаний).

По данным следствия, Олег Яровой при пособничестве Авериной и Куклина в 2017 году осуществил заведомо ложный донос о совершении своей знакомой мошенничества, а также организовал дачу ложных показаний на нее свидетелями Федосеевым и Кулибановым. Ференец в период с 2017 по 2018 год, превышая свои должностные полномочия, получал сведения о собранных доказательствах и ходе расследования указанного уголовного дела, которые передавал Авериной. Также он вмешался в деятельность следователя путем дачи ему незаконных указаний о возбуждении уголовного дела, избрании в отношении местной жительницы меры пресечения в виде подписки о невыезде и надлежащем поведении, и окончании расследования без проверки представленных обвиняемой доказательств, свидетельствующих об отсутствии в ее действиях состава инкриминируемого деяния. Впоследствии это уголовное дело прекращено в связи с отсутствием в действиях местной жительницы состава преступления.

Следствием собрана достаточная доказательственная база, в связи с чем уголовное дело с утвержденным обвинительным заключением направлено в суд для рассмотрения по существу. Уголовное дело в отношении Ярового выделено в отдельное производство и уже рассматривается в суде.

В Калининградской области мужчина подозревается в покушении на убийство беременной жены и дочери

Следственными органами Следственного комитета Российской Федерации по Калининградской области в отношении 34-летнего жителя поселка Коврово Зеленоградского района возбуждено уголовное дело. Мужчина подозревается в совершении преступлений, предусмотренных ч. 3 ст. 30 п. «а», п. «в», п. «г» ч. 2 ст. 105 УК РФ (покушение на убийство двух лиц, малолетнего, женщины, заведомо для виновного находящейся в состоянии беременности) и п. «г», п. «д» ч. 2 ст. 127 УК РФ (незаконное лишение свободы, совершенное с применением оружия, в отношении заведомо несовершеннолетнего).

По версии следствия, в ночь на 12 августа текущего года, подозреваемый, пребывая в состоянии алкогольного опьянения у себя в доме напал с ножом и топором на свою жену, находящуюся на 9-м месяце беременности, ранил ее. Женщине удалось выбежать на улицу и обратиться за помощью к соседям. Мужчина остался в доме, где находились трое малолетних детей (двое сыновей женщины 9-ти и 6-ти лет и их совместная 2-хлетняя дочь).

Мальчики спали на втором этаже дома, девочку же мужчина взял на руки и, схватив нож, угрожал убить ребенка. Переговоры с мужчиной длились несколько часов. Бойцами специального отряда быстрого реагирования «Викинг» регионального управления Росгвардии подозреваемый был обезврежен. Девочка не пострадала. В настоящее время подозреваемый задержан, с ним работают следователи регионального управления Следственного комитета. Потерпевшей женщине и детям оказана необходимая медицинская и психологическая помощь.

По уголовному делу выполняется полный комплекс следственных действий, направленных на детальное установление всех обстоятельств совершенных преступлений, установление мотива их совершения, а также причин и условий, им способствовавших. Установлено, что ранее семья в поле зрения правоохранительных и надзорных органов не попадала, подозреваемый к уголовной ответственности не привлекался. Расследование уголовного дела продолжается.

антагонист TGFβRI ингибирует индуцированный Nef ВИЧ-1 лиганд 2 семейства хемокинов CC (CCL2) в головном мозге и предотвращает нарушение пространственного обучения | Журнал нейровоспаления

Клиффорд Д.Б., Ансис Б.М. Нейрокогнитивное расстройство, связанное с ВИЧ. Ланцет Инфекционные болезни. 2013. 13 (11): 976–86.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

Шеппард Д.П., Вудс С.П., Бонди М.В., Гилберт П.Е., Массман П.Дж., Дойл К.Л. и др.Свидетельствует ли пожилой возраст повышенный риск возникновения нейрокогнитивных расстройств у людей, живущих с ВИЧ? Клинический нейропсихолог. 2015; 29 (5): 656–77.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

Meyer JS, Xu G, Thornby J, Chowdhury MH, Quach M. Является ли умеренное когнитивное нарушение продромальным фактором сосудистой деменции, такой как болезнь Альцгеймера? Гладить. 2002. 33 (8): 1981–5.

PubMed Статья Google Scholar

Сами Сарибас А., Цикалезе С., Ахуи Т.М., Халили К., Амини С., Сарыер И.К. Nef ВИЧ-1 высвобождается во внеклеточные везикулы, происходящие из астроцитов: доказательства Nef-опосредованной нейротоксичности. Cell Death Dis. 2017; 8: e2542.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

Hill JD, Zuluaga-Ramirez V, Gajghate S, Winfield M, Persidsky Y. Хроническая внутригиппокампальная инфузия нейротоксических белков ВИЧ-1: новая мышиная модель воспаления, связанного с ВИЧ-1, и дисфункции нервных стволовых клеток.Журнал нейроиммунной фармакологии. 2019.

Ван Марл Г., Генри С., Тодорук Т., Салливан А., Сильва С., Рурк С.Б. и др. Белок Nef вируса иммунодефицита человека 1 типа опосредует гибель нервных клеток: нейротоксическая роль IP-10. Вирусология. 2004. 329 (2): 302–18.

PubMed Статья CAS Google Scholar

Торрес-Муньос Дж., Стоктон П., Такоронте Н., Робертс Б., Маронпот Р. Р., Петито К. К.. Обнаружение последовательностей гена ВИЧ-1 в нейронах гиппокампа, выделенных из головного мозга после смерти больных СПИДом, с помощью микродиссекции с лазерным захватом.

J Neuropathol Exp Neurol. 2001. 60 (9): 885–92.

CAS PubMed Статья Google Scholar

Overholser ED, Coleman GD, Bennett JL, Casaday RJ, Zink MC, Barber SA, et al. Экспрессия nef вируса иммунодефицита обезьян (SIV) в астроцитах во время острой и терминальной инфекции и потребность в nef для оптимальной репликации нейровирулентного SIV in vitro. J Virol. 2003. 77 (12): 6855–66.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

Ранки А., Нюберг М., Овод В., Халтия М., Эловаара И., Райнинко Р. и др. Обильная экспрессия белков Nef и Rev ВИЧ в астроцитах мозга in vivo связана с деменцией. СПИД. 1995. 9 (9): 1001–8.

CAS PubMed Статья Google Scholar

10.

Раймонд А.Д., Диас П., Шевелон С., Агудело М., Индарт-Ариас А., Динг Х. и др. Вызванное микроглией нарушение гематоэнцефалического барьера экзосомой Nef + ВИЧ поддается лечению с помощью доставки пептидов Nef на основе наномедицины. Журнал нейровирологии. 2016; 22 (2): 129–39.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

11.

Хан М.Б., Ланг М.Дж., Хуанг М.Б., Раймонд А., Бонд В.К., Ширамизу Б. и др. Экзосомы Nef, выделенные из плазмы людей с ВИЧ-ассоциированной деменцией (HAD), могут индуцировать секрецию Abeta (1-42) в нервных клетках SH-SY5Y. Журнал нейровирологии. 2016; 22 (2): 179–90.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

12.

Olivetta E, Percario Z, Fiorucci G, Mattia G, Schiavoni I, Dennis C и др. Nef ВИЧ-1 вызывает высвобождение воспалительных факторов из моноцитов / макрофагов человека: участие эндоцитотических сигналов Nef и активация NF-каппа B. J Immunol. 2003. 170 (4): 1716–27.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

13.

Lamers SL, Fogel GB, Singer EJ, Salemi M, Nolan DJ, Huysentruyt LC, et al. Nef ВИЧ-1 в патогенезе макрофагально-опосредованных заболеваний.Международные обзоры иммунологии. 2012. 31 (6): 432–50.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

14.

Чжоу Ф., Лю Х, Цзо Д., Сюэ М., Гао Л., Ян И и др. Индуцированная Nef ВИЧ-1 днРНК AK006025 регулирует экспрессию кластерного гена CXCL9 / 10/11 в астроцитах посредством взаимодействия с CBP / P300. Журнал нейровоспаления. 2018; 15 (1): 303.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

15.

Chompre G, Cruz E, Maldonado L, Rivera-Amill V, Porter JT, Noel RJ Jr. Астроцитарная экспрессия Nef ВИЧ-1 ухудшает пространственную память и память распознавания. Нейробиология болезней. 2013. 49 (0): 128–36.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

16.

Леманн М.Х., Масанец С., Крамер С.

, Эрфле В. ВИЧ-1 Nef усиливает экспрессию CCL2 / MCP-1 в астроцитах миристоилированием и кальмодулином-зависимым образом.J Cell Sci. 2006. 119 (21): 4520–30.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

17.

Del Rio-Iniguez I, Vazquez-Chavez E, Cuche C, Di Bartolo V, Bouchet J, Alcover A. ВИЧ-1 Nef захватывает эндосомный трафик Lck и Rac1, чтобы модулировать опосредованный сигналом и актиновый цитоскелет. опосредованные функции Т-клеток. J Immunol. 2018; 201 (9): 2624–40.

PubMed Статья CAS PubMed Central Google Scholar

18.

Jelicic K, Cimbro R, Nawaz F, Huang da W, Zheng X, Yang J и др. Белок оболочки gp120 ВИЧ-1 нарушает пролиферацию В-клеток, индуцируя продукцию TGF-beta1 и экспрессию FcRL4. Nat Immunol. 2013. 14 (12): 1256–65.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

19.

Furler RL, Uittenbogaart CH. GLI2 регулирует TGF-beta1 в CD4 + Т-клетках человека: влияние на патогенез рака и ВИЧ. PLoS ONE.2012; 7 (7): e40874.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

20.

Ван Дж., Гуань Э., Родерикес Дж., Норкросс, Массачусетс. Синергетическая индукция апоптоза в первичных CD4 (+) Т-клетках макрофаг-тропным ВИЧ-1 и TGF-бета1. J Immunol. 2001. 167 (6): 3360–6.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

21.

Сато К., Кавасаки Х., Нагаяма Х., Эномото М., Моримото С., Тадокоро К. и др.TGF-бета 1 реципрокно контролирует хемотаксис дендритных клеток периферической крови человека, происходящих из моноцитов, через хемокиновые рецепторы. J Immunol. 2000. 164 (5): 2285–95.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

22.

Prehn JH, Krieglstein J. Противоположные эффекты трансформирующего фактора роста-бета 1 на нейротоксичность глутамата. Неврология. 1994. 60 (1): 7–10.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

23.

Prehn JH, Backhauss C, Krieglstein J. Трансформирующий фактор роста-бета 1 предотвращает нейротоксичность глутамата в культурах неокортекса крыс и защищает неокортекс мыши от ишемического повреждения in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 1993. 13 (3): 521–5.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

24.

Луо Дж., Хо П.П., Баквалтер М.С., Хсу Т., Ли Л.Й., Чжан Х. и др. Глия-зависимая передача сигналов TGF-бета, действующая независимо от пути Th27, имеет решающее значение для инициации аутоиммунного энцефаломиелита у мышей.J Clin Invest. 2007. 117 (11): 3306–15.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

25.

Johnson MD, Kim P, Tourtellotte W, Federspiel CF. Бета-трансформирующий фактор роста и хемотаксический белок-1 моноцитов повышены в спинномозговой жидкости пациентов с ослабленным иммунитетом и ВИЧ-1-инфекцией. J NeuroAIDS. 2004. 2 (4): 33–43.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

26.

Зеттерберг Х., Андреасен Н., Бленноу К. Повышенные уровни спинномозговой жидкости трансформирующего фактора роста-бета1 при болезни Альцгеймера. Neurosci Lett. 2004. 367 (2): 194–6.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

27.

Finch CE, Laping NJ, Morgan TE, Nichols NR, Pasinetti GM. TGF-бета 1 — организатор ответов на нейродегенерацию. J Cell Biochem. 1993. 53 (4): 314–22.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

28.

Konig HG, Kogel D, Rami A, Prehn JH. TGF- {beta} 1 активирует два различных рецептора типа I в нейронах: значение для нейрональной передачи сигналов NF- {kappa} B. J Cell Biol. 2005. 168 (7): 1077–86.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

29.

Bae JJ, Xiang YY, Martinez-Canabal A, Frankland PW, Yang BB, Lu WY. Повышенный уровень трансформирующего фактора роста бета1 модулирует экспрессию рецептора глутамата в гиппокампе.Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 2011; 3 (1): 9–20.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

30.

Баквалтер М.С., Ямане М., Коулман Б.С., Ормерод Б.К., Чин Дж. Т., Палмер Т. и др. Хронически повышенный уровень трансформирующего фактора роста бета1 сильно ингибирует нейрогенез в гиппокампе у старых мышей. Am J Pathol. 2006. 169 (1): 154–64.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

31.

Uhl M, Aulwurm S, Wischhusen J, Weiler M, Ma JY, Almirez R, et al. SD-208, новый ингибитор киназы бета-рецептора I трансформирующего фактора роста, подавляет рост и инвазивность, а также повышает иммуногенность клеток глиомы мыши и человека in vitro и in vivo. Cancer Res. 2004. 64 (21): 7954–61.

CAS PubMed Статья Google Scholar

32.

Mohammad KS, Javelaud D, Fournier PG, Niewolna M, McKenna CR, Peng XH, et al.Ингибитор киназы TGF-бета-RI SD-208 снижает развитие и прогрессирование метастазов меланомы в кости. Cancer Res. 2011. 71 (1): 175–84.

CAS PubMed Статья Google Scholar

33.

Манаенко А., Лекич Т., Барнхарт М., Хартман Р., Чжан Дж. Х. Ингибирование трансформирующего фактора роста-β ослабляет повреждение головного мозга и неврологический дефицит на крысиной модели кровоизлияния в зародышевый матрикс. Гладить. 2014; 45 (3): 828–34.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

34.

Торрес Л., Ноэль Р.Дж. Астроцитарная экспрессия вирусного белка R ВИЧ-1 в гиппокампе вызывает хроматолиз, синаптическую потерю и нарушение памяти. Журнал нейровоспаления. 2014; 11 (1): 53.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

35.

Cruz ML, Cintron K, Isidro RA, Hernandez S, Maldonado A, Isidro AA, et al. Астроцитарная экспрессия Nef ВИЧ-1 вызывает нарушение обучения и воспаление. Журнал нейроиммунной фармакологии: официальный журнал Общества нейроиммунной фармакологии.2015; 10 (S2): 66.

Google Scholar

36.

Lamers SL, Poon AFY, McGrath MS. Белковые структуры Nef ВИЧ-1, связанные с патогенезом инфекции мозга и деменции. PLoS ONE. 2011; 6 (2): e16659.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

37.

Чаухан А., Турчан Дж., Поцернич С., Брюс-Келлер А., Рот С., Баттерфилд Д.А. и др. Экспрессия Tat вируса внутриклеточного иммунодефицита человека в астроцитах способствует выживанию астроцитов, но вызывает сильную нейротоксичность в отдаленных участках через аксональный транспорт.J Biol Chem. 2003. 278 (15): 13512–9.

CAS PubMed Статья Google Scholar

38.

Johnson MD, Gold LI. Распространение изоформ трансформирующего фактора роста бета при энцефалите, вызванном вирусом иммунодефицита человека-1. Hum Pathol. 1996. 27 (7): 643–9.

CAS PubMed Статья Google Scholar

39.

Qi W, Chen X, Polhill TS, Sumual S, Twigg S, Gilbert RE, et al.TGF-β ₁ индуцирует IL-8 и MCP-1 через независимый от фактора роста соединительной ткани путь. Американский журнал физиологии — физиология почек. 2006; 290 (3): F703 – F9.

CAS PubMed Статья Google Scholar

40.

Zhang F, Tsai S, Kato K, Yamanouchi D, Wang C, Rafii S, et al. Трансформирующий фактор роста-β способствует привлечению клеток костного мозга и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга за счет стимуляции выработки МСР-1 в гладкомышечных клетках сосудов.Журнал биологической химии. 2009. 284 (26): 17564–74.

CAS PubMed Статья Google Scholar

41.

Bethel-Brown C, Yao H, Hu G, Buch S. Фактор роста тромбоцитов (PDGF) -BB-опосредованная индукция моноцитарного хемоаттрактантного белка 1 в человеческих астроцитах: последствия для ВИЧ-ассоциированного нейровоспаления. Журнал нейровоспаления. 2012; 9 (1): 262.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

42.

Гонсалес Э., Ровин Б.Х., Сен Л., Кук Дж., Дханда Р., Муммиди С. и др. На инфекцию ВИЧ-1 и деменцию при СПИДе влияет мутантный аллель MCP-1, связанный с повышенной инфильтрацией тканей моноцитами и уровнями MCP-1. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2002; 99 (21): 13795–800.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

43.

Abraham S, Sawaya BE, Safak M, Batuman O, Khalili K, Amini S. Регулирование транскрипции гена MCP-1 с помощью Smads и HIV-1 Tat в глиальных клетках человека.Вирусология. 2003. 309 (2): 196–202.

CAS PubMed Статья Google Scholar

44.

Райзер Б.Л., Ладсон-Уоффорд С., Шарба А., Кортес П., Дрейк К., Герин С.Дж. и др. Экспрессия и связывание рецептора TGF-бета в мезангиальных клетках крыс: модуляция глюкозой и циклической механической нагрузкой. Почки международные. 1999. 56 (2): 428–39.

CAS PubMed Статья Google Scholar

45.

Hamby ME, Hewett JA, Hewett SJ. Smad3-зависимая передача сигналов лежит в основе опосредованного TGF-beta1 усиления экспрессии iNOS астроцитов. Глия. 2010. 58 (11): 1282–91.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

46.

Чандра М., Занг С., Ли Х, Циммерман Л.Дж., Чампер Дж., Цуяда А. и др. Ядерная транслокация рецептора β трансформирующего фактора роста I типа обеспечивает новую функцию в процессинге РНК. Молекулярная и клеточная биология.2012. 32 (12): 2183–95.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

47.

Hayes S, Chawla A, Corvera S. Интернализация рецептора TGF бета в EEA1-богатые ранние эндосомы: роль в передаче сигналов Smad2. J Cell Biol. 2002. 158 (7): 1239–49.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

48.

Абдолла С. Масас-Силва М., Цукадзаки Т., Хаяши Н., Аттисано Л., Врана Дж. Л.TβRI Фосфорилирование Smad2 на Ser465 и Ser467 необходимо для образования комплекса Smad2-Smad4 и передачи сигналов. Журнал биологической химии. 1997. 272 (44): 27678–85.

CAS PubMed Статья Google Scholar

49.

Алонсо-Мерино Е., Мартин Ороско Р., Руис-Льоренте Л., Мартинес-Иглесиас О.А., Веласко-Мартин Дж. П., Монтеро-Педрасуэла А. и др. Гормоны щитовидной железы подавляют передачу сигналов TGF-β и ослабляют фиброзные реакции. Труды Национальной академии наук.2016; 201506113.

50.

Fabriek BO, Dijkstra CD, van den Berg TK. Рецептор скавенджера макрофагов CD163. Иммунобиология. 2005. 210 (2–4): 153–60.

CAS PubMed Статья Google Scholar

51.

Хольшер К. Стресс ухудшает успеваемость при выполнении задач по обучению пространственному водному лабиринту. Behav Brain Res. 1999. 100 (1-2): 225–35.

CAS PubMed Статья Google Scholar

52.

Асеведо С.Ф., Охцу Х., Бенис Т.С., Ризк-Джексон А., Рабер Дж. Возрастные критерии тревожности и когнитивных способностей у самцов мышей с нокаутом гистидиндекарбоксилазы (Hdc — / -). Brain Res. 2006; 1071 (1): 113–23.

CAS PubMed Статья Google Scholar

53.

Acharjee S, Branton WG, Vivithanaporn P, Maingat F, Paul AM, Dickie P, et al. Экспрессия Nef ВИЧ-1 в микроглии нарушает дофаминергические и иммунные функции с ассоциированным маниакальным поведением.Мозг, поведение и иммунитет. 2014; 40: 74–84.

CAS PubMed Статья Google Scholar

54.

Ма Дж, Ван Кью, Фей Т, Хан ДжиДи, Чен ЮГ. МСР-1 опосредует индуцированный TGF-бета ангиогенез, стимулируя миграцию гладкомышечных клеток сосудов. Кровь. 2007. 109 (3): 987–94.

CAS PubMed Статья Google Scholar

55.

Йошимура Х., Накахама К., Сафронова О., Танака Н., Мунета Т., Морита И.Трансформирующий фактор роста-β стимулирует индуцированную IL-1β экспрессию хемоаттрактантного белка-1 моноцитов в синовиальных клетках человека через путь ERK / AP-1. Исследование воспаления. 2006. 55 (12): 543–9.

CAS PubMed Статья Google Scholar

56.

Тейлор Р.А., Чанг С.Ф., Гудз Б.А., Хаммонд М.Д., Мак Грори Б., Ай И и др. TGF-β1 модулирует фенотип микроглии и способствует восстановлению после внутримозгового кровоизлияния. Журнал клинических исследований.2017; 127 (1): 280–92.

PubMed Статья Google Scholar

57.

Banisadr G, Gosselin RD, Mechighel P, Kitabgi P, Rostene W, Parsadaniantz SM. Сильно регионализированная нейрональная экспрессия моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (MCP-1 / CCL2) в головном мозге крысы: доказательства его совместной локализации с нейротрансмиттерами и нейропептидами. Журнал сравнительной неврологии. 2005. 489 (3): 275–92.

CAS PubMed Статья Google Scholar

58.

Luo J, Lin AH, Masliah E, Wyss-Coray T. Визуализация биолюминесценции передачи сигналов Smad у живых мышей показывает корреляцию с эксайтотоксической нейродегенерацией. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2006; 103 (48): 18326–31.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

59.

Тон Х, Сюн Х. Дисфункции астроцитов и нейротоксичность ВИЧ-1. Журнал СПИДа и клинических исследований. 2013; 4 (11): 255.

Google Scholar

60.

Охеда Д., Лопес-Коста Дж., Седе М., Лопес Е.М., Берриа М.И., Куарлери Дж. Повышенная экспрессия глиального фибриллярного кислого белка, активность теломеразы и длина теломер in vitro после инфицирования продуктивным вирусом иммунодефицита человека-1 в мышиных астроцитах. J Neurosci Res. 2014; 92 (2): 267–74.

CAS PubMed Статья Google Scholar

61.

Ли Г.Х., Хендерсон Л., Нат А. Астроциты как резервуар ВИЧ: механизм ВИЧ-инфекции.Curr HIV Res. 2016; 14 (5): 373–81.

CAS PubMed Статья Google Scholar

62.

Евгенин Э.А., Берман Ж.В. Нарушение регуляции цитохрома С, вызванное ВИЧ-инфекцией астроцитов, приводит к случайному апоптозу неинфицированных астроцитов по IP3 и кальций-зависимому механизму. J Neurochem. 2013; 127 (5): 644–51.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

63.

Васкес-Сантьяго Ф.Дж., Ноэль Р.Дж.-младший, Портер Дж.Т., Ривера-Амилл В. Метаболизм глутамата и нейрокогнитивные расстройства, связанные с ВИЧ. Журнал нейровирологии. 2014. 20 (4): 315–31.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

64.

Евгенин Е.А., Клементс Дж. Э., Цинк М. С., Берман Дж. В.. Инфекция человеческих астроцитов вирусом иммунодефицита человека нарушает целостность гематоэнцефалического барьера по механизму, зависящему от щелевых соединений.Журнал неврологии: официальный журнал Общества нейробиологии. 2011. 31 (26): 9456–65.

CAS Статья Google Scholar

65.

Reilly JF, Maher PA, Kumari VG. Регулирование экспрессии GFAP в астроцитах с помощью TGF-beta1 и FGF-2. Глия. 1998. 22 (2): 202–10.

CAS PubMed Статья Google Scholar

66.

Ilzecka J, Stelmasiak Z, Dobosz B.Трансформирующий фактор роста-бета 1 (tgf-Beta 1) у пациентов с боковым амиотрофическим склерозом. Цитокин. 2002. 20 (5): 239–43.

CAS PubMed Статья Google Scholar

67.

Endo F, Komine O, Fujimori-Tonou N, Katsuno M, Jin S, Watanabe S, et al. TGF-β1, полученный из астроцитов, ускоряет прогрессирование заболевания у мышей с БАС, нарушая нейрозащитные функции микроглии и Т-клеток. Отчеты по ячейкам. 2015; 11 (4): 592–604.

CAS PubMed Статья Google Scholar

68.

Лю X, Кумар А. Дифференциальный сигнальный механизм для Nef-опосредованного производства ВИЧ-1 IL-6 и IL-8 в человеческих астроцитах. Научные отчеты. 2015; 5: 9867.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

69.

Шиптон О.А., Эль-Габи М., Апергис-Скоут Дж., Дейссерот К., Баннерман Д.М., Паульсен О. и др.Диссоциация процессов памяти в гиппокампе у мышей слева направо. Труды Национальной академии наук. 2014. 111 (42): 15238–43.

CAS Статья Google Scholar

70.

Ezzati A, Katz MJ, Zammit AR, Lipton ML, Zimmerman ME, Sliwinski MJ, et al. Дифференциальная связь объемов левого и правого гиппокампа с вербальной эпизодической и пространственной памятью у пожилых людей. Нейропсихология. 2016; 93: 380–5.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

71.

Gisolf EH, van Praag RME, Jurriaans S, Portegies P, Goudsmit J, Danner SA и др. Повышение концентрации хемокинов в спинномозговой жидкости, несмотря на неопределяемую РНК ВИЧ в спинномозговой жидкости у ВИЧ-1-инфицированных пациентов, получающих антиретровирусную терапию. Журнал JAIDS по синдромам приобретенного иммунодефицита. 2000. 25 (5): 426–33.

CAS PubMed Статья Google Scholar

72.

Уильямс Д.В., Кальдерон Т.М., Лопес Л., Карвалло-Торрес Л., Гаскилл П.Дж., Евгенин Е.А. и др.Механизмы проникновения ВИЧ в ЦНС: повышенная чувствительность ВИЧ-инфицированных моноцитов CD14 + CD16 + к CCL2 и ключевые роли CCR2, JAM-A и ALCAM в диапедезе. PLoS ONE. 2013; 8 (7): e69270.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

73.

Черчилль MJ, Wesselingh SL, Cowley D, Pardo CA, McArthur JC, Brew BJ, et al. Обширная инфекция астроцитов характерна для деменции, связанной с вирусом иммунодефицита человека.Анналы неврологии. 2009. 66 (2): 253–8.

PubMed Статья Google Scholar

74.

Нарасипура С.Д., Ким С., Аль-Харти Л. Эпигенетическая регуляция латентного периода ВИЧ-1 в астроцитах. Журнал вирусологии. 2014. 88 (5): 3031–8.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

75.

Аль-Харти Л., Нат А. Письмо в редакцию. Журнал нейроиммунной фармакологии: официальный журнал Общества нейроиммунной фармакологии.2019; 14 (1): 6.

Артикул Google Scholar

76.

Li GH, Anderson C, Jaeger L, Do T, Major EO, Nath A. Межклеточный контакт облегчает передачу ВИЧ от лимфоцитов к астроцитам через CXCR4. СПИД. 2015. 29 (7): 755–66.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

77.

Фердин Дж., Горичар К., Должан В., Племениташ А., Мартин Дж. Н., Петерлин Б. М. и др.Вирусный белок Nef обнаруживается в плазме половины ВИЧ-инфицированных взрослых с неопределяемой плазменной РНК ВИЧ. PLoS ONE. 2018; 13 (1): e01

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

78.

Wyss-Coray T, Feng L, Masliah E, Ruppe MD, Lee HS, Toggas SM, et al. Повышенная выработка центральной нервной системой компонентов внеклеточного матрикса и развитие гидроцефалии у трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих трансформирующий фактор роста бета 1.Am J Pathol. 1995. 147 (1): 53–67.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

79.

Wahl SM, Hunt DA, Wakefield LM, McCartney-Francis N, Wahl LM, Roberts AB, et al. Трансформирующий фактор роста бета индуцирует хемотаксис моноцитов и продукцию фактора роста. Труды Национальной академии наук. 1987. 84 (16): 5788–92.

CAS Статья Google Scholar

80.

Хироюки М., Михо С., Хироко Х., Кентаро С. Хемоаттрактантный белок-1 моноцитов генерируется миофибробластами с помощью TGF-β в желудочно-кишечной метаплазии и карциноме без инфекции H. pylori. Наука о раке. 2010. 101 (8): 1783–9.

Артикул CAS Google Scholar

81.

Яманака Я., Джинджери А, Оки Дж., Ян Т. Х., Чжао С., Амадио ПК. Блокирование фиброзной передачи сигналов в фибробластах пациентов с синдромом запястного канала. Журнал клеточной физиологии.2018; 233 (3): 2067–74.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

82.

Ого Т., Чоудхури Х.М., Ян Дж., Лонг Л., Ли Х, Клурен YNT и др. Ингибирование сверхактивной передачи сигналов трансформирующего фактора роста – β аналогами простациклина при легочной артериальной гипертензии. Американский журнал респираторной клетки и молекулярной биологии. 2013. 48 (6): 733–41.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

83.

Stacer AC, Nyati S, Moudgil P, Iyengar R, Luker KE, Rehemtulla A, et al. Репортер NanoLuc для получения изображений с двойной люциферазой у живых животных. Молекулярная визуализация. 2013; 12 (7): 1–13.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

84.

Сегава С., Гото Д., Йошига Ю., Сугихара М., Хаяси Т., Чино Ю. и др. Ингибирование передачи сигналов трансформирующего фактора роста-бета ослабляет интерстициальное заболевание легких, индуцированное интерлейкином (ИЛ) -18 плюс ИЛ-2, у мышей.Clin Exp Immunol. 2010. 160 (3): 394–402.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

85.

Келдер В., МакАртур Дж. К., Нэнс-Спросон Т., МакКлернон Д., Гриффин Д. Бета-хемокины MCP-1 и RANTES избирательно увеличиваются в спинномозговой жидкости пациентов с деменцией, связанной с вирусом иммунодефицита человека. Энн Нейрол. 1998. 44 (5): 831–5.

CAS PubMed Статья Google Scholar

86.

Hsieh CL, Niemi EC, Wang SH, Lee CC, Bingham D, Zhang J и др. Дефицит CCR2 нарушает инфильтрацию макрофагов и улучшает когнитивные функции после черепно-мозговой травмы. Журнал нейротравмы. 2014; 31 (20): 1677–88.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

87.

Морганти Дж. М., Джопсон Т. Д., Лю С., Рипарип Л. К., Гуандик К. К., Гупта Н. и др. Антагонизм CCR2 изменяет поляризацию макрофагов мозга и улучшает когнитивную дисфункцию, вызванную черепно-мозговой травмой.Журнал неврологии. 2015; 35 (2): 748–60.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

88.

Беларби К., Джопсон Т., Ареллано С., Фике Дж. Р., Рози С. Дефицит CCR2 предотвращает нейрональную дисфункцию и когнитивные нарушения, вызванные облучением черепа. Исследования рака. 2013. 73 (3): 1201–10.

CAS PubMed Статья Google Scholar

89.

Cekanaviciute E, Dietrich HK, Axtell RC, Williams AM, Egusquiza R, Wai KM, et al. Передача сигналов астроцитарного TGF-β ограничивает воспаление и уменьшает повреждение нейронов при заражении центральной нервной системой токсоплазмой . Журнал иммунологии. 2014. 193 (1): 139–49.

CAS PubMed Статья Google Scholar

90.

Rustenhoven J, Aalderink M, Scotter EL, Oldfield RL, Bergin PS, Mee EW, et al. TGF-бета1 регулирует воспалительные процессы перицитов головного мозга человека, участвующие в нейрососудистой функции.Журнал нейровоспаления. 2016; 13 (1): 37.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

91.

Ким Дж. С., Ким Дж. Г., Мун М-И, Чон Си, Вон Х-Й, Ким Х-Дж и др. Трансформирующий фактор роста-β1 регулирует миграцию макрофагов через RhoA. Кровь. 2006. 108 (6): 1821–9.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

92.

Ли EY, Chung CH, Khoury CC, Yeo TK, Pyagay PE, Wang A и др. Петля хемоаттрактантный белок-1 / CCR2 моноцитов, индуцируемая TGF-β, увеличивает подвижность подоцитов и проницаемость для альбумина. Американский журнал физиологии-физиологии почек. 2009; 297 (1): F85–94.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

93.

Moustakas A, Souchelnytskyi S, Heldin C-H. Smad-регуляция передачи сигнала TGF-β.Журнал клеточной науки. 2001. 114 (24): 4359–69.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

94.

Массагуэ Дж., Сеоан Дж., Уоттон Д. Факторы транскрипции Смада. Гены и развитие. 2005. 19 (23): 2783–810.

Артикул CAS Google Scholar

95.

Накашима Х., Цудзимура К., Ирие К., Ишизу М., Пан М., Камеда Т. и др. Каноническая передача сигналов TGF-β негативно регулирует морфогенез нейронов посредством подавления CRMP2, опосредованного комплексом TGIF / Smad.Журнал неврологии. 2018; 38 (20): 4791–810.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

96.

Лойс Б.Л., Чен Дж., Нептун Е.Р., судья Д.П., Подовски М., Холм Т. и др. Синдром измененного сердечно-сосудистого, черепно-лицевого, нейрокогнитивного и скелетного развития, вызванный мутациями в TGFBR1 или TGFBR2. Генетика природы. 2005. 37 (3): 275–81.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

97.

Ле Гофф С., Махо С., Абхьянкар А., Ле Гофф В., Серр В., Афенджар А. и др. Мутации в одном кодоне в домене Mad homology 2 SMAD4 вызывают синдром Myhre. Генетика природы. 2011; 44: 85.

PubMed Статья CAS PubMed Central Google Scholar

98.

He Y, Zhang H, Yung A, Villeda SA, Jaeger PA, Olayiwola O, et al. ALK5-зависимая передача сигналов TGF-β является основным детерминантом поздней стадии нейрогенеза взрослых. Природа нейробиологии.2014; 17 (7): 943–52.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

99.

Якимович И., Якимович М, Хельдин Ц.-Х. Внутриклеточный транспорт рецепторов трансформирующего фактора роста β. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2017; 50 (1): 3–11.

Артикул CAS Google Scholar

100.

Ву Л., Деринк Р. Существенная роль передачи сигналов TGF-бета в индуцированной глюкозой клеточной гипертрофии.Клетка развития. 2009. 17 (1): 35–48.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

101.

Му Й, Сундар Р., Такур Н., Экман М., Гудей С.К., Якимович М. и др. TRAF6 убиквитинирует рецептор TGFbeta типа I, способствуя его расщеплению и ядерной транслокации при раке. Связь природы. 2011; 2: 330.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

102.

Bardita C, Predescu DN, Sha F, Patel M, Balaji G, Predescu SA. Эндоцитарная недостаточность, вызванная нокдауном ITSN-1, изменяет сигнальный баланс Smad2 / 3-Erk1 / 2 ниже по течению от Alk5. Журнал клеточной науки. 2015; 128 (8): 1528–41.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

103.

Miller DSJ, Bloxham RD, Jiang M, Gori I, Saunders RE, Das D, et al. Динамика передачи сигналов TGF-бета диктуется переносом рецепторов через механизм ESCRT.Cell Rep. 2018; 25 (7): 1841–55.e5.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

104.

daSilva LLP, Sougrat R, Burgos PV, Janvier K, Mattera R, Bonifacino JS. Белок Nef вируса иммунодефицита человека типа 1 нацелен на CD4 по мультивезикулярному пути в организме. Журнал вирусологии. 2009. 83 (13): 6578–90.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

105.

Сайто Й., Акционер Л. Р., Эпштейн Л. Г., Майклс Дж., Минц М., Лаудер М. и др. Сверхэкспрессия nef как маркера ограниченной ВИЧ-1 инфекции астроцитов в тканях центральной нервной системы детей после смерти. Неврология. 1994; 44 (3 Pt 1): 474–81.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

106.

Андерсон К.Э., Томлинсон Г.С., Поли Б., Браннан Ф.В., Чизвик А., Брак-Вернер Р. и др. Связь Nef-позитивных и GFAP-реактивных астроцитов с употреблением наркотиков при ранней и поздней ВИЧ-инфекции.Neuropathol Appl Neurobiol. 2003. 29 (4): 378–88.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

107.

Hardingham GE. Связывание рецептора NMDA с нейропротективными и нейродеструктивными событиями. Biochem Soc Trans. 2009; 37 (Pt 6): 1147–60.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

108.

Шульц Дж.Б., Мэтьюз Р.Т., Клокгайд Т., Дичганс Дж., Бил М.Ф.Роль митохондриальной дисфункции и нейронального оксида азота в моделях нейродегенеративных заболеваний на животных. Mol Cell Biochem. 1997. 174 (1-2): 193-7.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

109.

Сурядевара Р., Холтер С., Боргманн К., Персидский Р., Лабенз-Цинк С., Персидский Ю. и др. Регулирование тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 астроцитами: связь с деменцией ВИЧ-1. Глия. 2003. 44 (1): 47–56.

PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

110.

Дхар А., Гарднер Дж., Боргманн К., Ву Л., Горпейд А. Новая роль TGF-β в дифференциальной регуляции астроцитов-TIMP-1: последствия для ВИЧ-1-деменции и нейровоспаления. Журнал неврологических исследований. 2006. 83 (7): 1271–80.

CAS PubMed Статья Google Scholar

111.

Tuluc F, Meshki J, Spitsin S, Douglas SD.ВИЧ-инфекция макрофагов усиливается в присутствии повышенной экспрессии CD163, индуцированной веществом Р. Журнал биологии лейкоцитов. 2014; 96 (1): 143–50.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

Емкостные характеристики монолитного электрода NaxV2O5 / CC толщиной 330 мкм за счет синергизма иерархической структуры пор и сверхмассивной нагрузки

Для решения давней проблемы обычных суперконденсаторов, , а именно .их подача энергии и мощности в значительной степени снижается из-за плохой плотности упаковки, особенно активных электродов, в настоящем исследовании предлагается сверхкомпактный, но пористый монолитный электрод. В частности, он построен на электроактивном α’-Na _x V ₂ O ₅ с поверхностной массовой нагрузкой 33,24 мг · см ⁻² , плотно упакованной в Углеродная ткань толщиной 330 мкм и, что более важно, с иерархической структурой мезо- / нанопор в пользу переноса ионов через этот α’-Na толщиной 330 мкм _x V ₂ O ₅ / CC тяжелый электрод.В этом контексте ряд превосходных характеристик, включая площадную, гравиметрическую и объемную емкости, достигающие 12,47 Ф · см ⁻² , 375,2 Ф · г ⁻¹ и 377,93 Ф · см ⁻³ и Этот компактный монолит с плотностью энергии и мощности 1,38 мВт ч см ⁻² и 34,1 мВт см ⁻² успешно передается на уровне электродов и устройств соответственно, что в целом значительно превосходит характеристики дополнительных устройств. современные и перспективные электроды и накопители энергии описаны в литературе.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуй еще раз?

Высокая экспрессия хемокинового рецептора 7 CC улучшает послеоперационный прогноз пациентов с аденокарциномой легких

Пациенты и образцы тканей

Это исследование было проведено в Онкологическом центре Чиба в соответствии с принципами Хельсинкской декларации с текущими поправками.Исследование было одобрено институциональными наблюдательными советами / комитетами по этике Онкологического центра Чиба. Все пациенты дали письменное информированное согласие. Для этого анализа случайным образом были отобраны 120 последовательных пациентов с аденокарциномой, которые лечились в отделении торакальных заболеваний онкологического центра Чиба с 1997 по 2004 год. Клинические данные для вовлеченных пациентов были получены из медицинских карт пациентов, рентгеновских снимков грудной клетки, снимков компьютерной томографии всего тела, данных сканирования костей и операционных записей.

В общей сложности 120 пациентам была выполнена полная резекция доли или сегмента, в котором находилась опухоль, и проведена диссекция внутригрудных и средостенных лимфатических узлов. Все образцы тканей немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до использования.

Для гистологического исследования образцы фиксировали в 10% (v v ^-1) формалине и затем заливали парафином. Из каждого образца готовили срез размером 4- мкм и размером мкм и окрашивали гематоксилином и эозином.

Патологическая стадия определялась с использованием существующей системы классификации метастазов опухолевых узлов (Международная ассоциация по изучению рака легких). Гистологический тип и степень дифференцировки клеток у этих пациентов были определены с использованием патологического диагноза двумя патологами онкологического центра патологии Чиба, а затем подтверждены одним патологом, специализирующимся на патологии легких, в соответствии с Системой классификации Всемирной организации здравоохранения 2004 года.

Выделение РНК и анализ ОТ-ПЦР

Суммарная РНК была выделена из резецированных образцов во время операции с использованием TRIzol (Invitrogen, Carsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя.

Для переваривания загрязняющей ДНК экстракт РНК инкубировали с ДНКазой I, не содержащей РНКаз (Amersham Pharmacia Biotech, Упсала, Швеция) во время выделения РНК. Обратную транскрипцию (ОТ) тотальной РНК выполняли с использованием Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, США) и случайных гексамеров (Amersham Biotech, США). Для количественной оценки экспрессии генов хемокинового лиганда и рецептора проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени с использованием ABI 7700 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя.Смысловые и антисмысловые праймеры, используемые для количественной амплификации мРНК CCR7, CCL19, CCL21, CrkL и c-ABL, а также праймеры, используемые для амплификации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), используемые в качестве внутреннего контроля, представлены в дополнительной таблице. 1.

Количественные данные анализировали с помощью программного обеспечения для анализа Light Cycler, версия 5.03 (Rosche Applied Science, Пенцберг, Германия). Каждый уровень экспрессии мРНК был стандартизирован с помощью экспрессии мРНК GAPDH, а затем они были указаны как отношение к образцу с наименьшей экспрессией в гене.

ген EGFR и TP53 Обнаружение мутации гена

Геномная ДНК была извлечена из каждого замороженного образца опухоли, и каждый экзон гена EGFR (экзоны 18–21) и TP53 гена (экзоны 4–8) ) был амплифицирован с помощью ПЦР (Shingyoji et al, 2011).

Иммуногистохимический анализ

Для иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания CrkL, c-ABL и CCR7 фиксированные формалином и залитые парафином (FFPE) срезы ткани нагревали при 98 ° C в течение 20 минут, а затем промывали PBS.Срезы инкубировали с козьим поликлональным антителом против CCR7 (8 мкг, мкг, мл ^-1; Abcam, Кембридж, Массачусетс, США), антифосфо-CrkL (Tyr207) антителом (20 мкг мкг, мл ^-1; Cell Signaling Technology, Дэнверс, Массачусетс, США), антифосфо (Y412) c-ABL антитела (20 мкг мкг / мл ^-1; Abcam) и контрольного козьего IgG-антитела (8 мкг мкг / мл ^-1; Beckman Coulter, Brea, CA, USA) для отрицательного контроля, как рекомендовано производителем или поставщиками.

После окрашивания вторичным антителом, конъюгированным с биотином, на образцы наносили пероксидазу хрена – стрептавидин, проводили контрастное окрашивание и оценивал характер окрашивания опытным патологом. Все срезы тканей, окрашенные ИГХ, сканировали с помощью системы сканирования NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Все анализы IHC проводились коллегами и медицинскими технологами, а анализы контролировались экспертами-патологами.

Микродиссекция с лазерным захватом, выделение РНК и ОТ из срезов FFPE

После окрашивания толуидиновым синим диссекцию проводили с использованием микроскопа для микродиссекции с лазерным захватом (Leica AS LMD; Leica Microsystems, Вецлар, Германия) с импульсным УФ-лазером с длиной волны 337 нм ( Leica Microsystems).Участки опухоли и нормальные легкие в срезах ткани FFPE были рассечены и собраны в отдельные пробирки, заполненные буфером PKD из набора RNeasy FFPE (Qiagen, Venlo, Нидерланды). Тотальную РНК очищали с помощью набора RNeasy FFPE (Qiagen). Комплементарный синтез ДНК выполняли с помощью набора для обратной транскрипции (Takara, Shiga, Japan), а затем проводили количественную ПЦР, как описано выше.

Обнаружение области экспрессии CCR7 в срезах ткани путем окрашивания ИГХ

Двадцать образцов FFPE были отобраны из каждого из 10 образцов экспрессии мРНК верхнего и нижнего CCR7 в 120 образцах, проанализированных в этом исследовании.Для измерения областей экспрессии CCR7 при раке легких все срезы тканей, окрашенные IHC, сканировали с помощью системы сканирования NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Япония). Затем пять изображений размером 3,5 × 1,96 мм были выбраны из данных сканированного изображения с помощью программного обеспечения изображений NDP (Hamamatsu Photonics). В программном обеспечении анализа ImageJ плагин ImageJ для деконволюции цвета имеет встроенный вектор для разделения окрашивания гематоксилином (H) и диаминобензидином (DAB) (Konsti et al, 2011). После цветовой деконволюции изображения DAB были обработаны.Установление пороговых значений создает двоичные маски DAB-положительных областей. Было подсчитано количество DAB-положительных пикселей. Результаты были указаны как процент DAB-положительных пикселей во всех пикселях изображения. Среднее значение пяти изображений было рассчитано для 20 образцов ткани. Результаты были указаны в процентах от среднего значения 10 образцов ткани групп с высокой экспрессией (CCR7-hi) и низкой экспрессией (CCR7-lo) мРНК CCR7.

Статистический анализ

Графики в виде прямоугольников и усов суммируют значения распределений в этом исследовании: центральный прямоугольник охватывает межквартильный диапазон, а медиана обозначена линией внутри прямоугольника.Усы простираются либо до значений процентилей 10 и 90%, либо до самых крайних значений в пределах 1,5 интерквартильных диапазонов квартилей, и в этом случае более экстремальные значения отображаются индивидуально (рисунки 1C – F, 2C – F и).

Рисунок 1

Влияние CrkL и c-ABL на выживаемость пациентов с хирургически удаленной аденокарциномой легкого. ( A ) Общая выживаемость по отношению к высокой (hi) и низкой (lo) экспрессии мРНК CrkL в опухолевом сайте ( P = 0.42, HR = 0,81, 95% ДИ отношения 0,49–1,34). ( B ) Общая выживаемость по отношению к экспрессии мРНК hi и lo c-ABL в опухолевом участке ( P = 0,72, HR = 0,91, 95% ДИ отношения 0,55–1,50). В ( C — F ) показано влияние мутаций гена EGFR и TP53 на экспрессию мРНК CrkL и c-ABL в образцах хирургически резецированной аденокарциномы легкого. Значения экспрессии мРНК CrkL и c-ABL в соответствии со статусом мутации гена EGFR показаны в виде прямоугольных и усых диаграмм ( C и D , соответственно).Значения экспрессии мРНК c-ABL и CrkL в соответствии со статусом мутации гена TP53 указаны в виде прямоугольников и диаграмм с усами ( E и F соответственно). * P -значение <0,01.

Рисунок 2

Эффекты CCR7 у пациентов с хирургически удаленной аденокарциномой легкого. ( A ) Общая выживаемость по отношению к высокой (hi) и низкой (lo) экспрессии мРНК CCR7 в опухолевом участке ( P = 0,007, HR = 0,50, 95% ДИ отношения 0,30–0.82). ( B ) Безрецидивная выживаемость в отношении экспрессии hi и lo CCR7 мРНК в опухолевом участке ( P = 0,007, HR = 0,50, 95% ДИ отношения 0,30–0,82). Две группы были сформированы в соответствии со статусом экспрессии мРНК CrkL и c-ABL, а затем значения относительных количеств мРНК CCR7, c-ABL и CrkL были оценены в каждой группе ( C — F ). * P -значение <0,0001.

Среднее значение ряда использовалось для классификации каждого случая как имеющего высокую или низкую экспрессию мРНК CCR7, CrkL и c-ABL, а также для сравнения их взаимосвязи с другими биологическими параметрами и клиническим наблюдением.Достоверность различий в категориальных данных проверялась с помощью теста × ². Различия между непрерывными переменными исследовались с помощью теста Стьюдента t , если непрерывные переменные были нормально распределены, или с помощью теста Манна-Уитни U , если не нормально распределены. Сравнение трех непрерывных переменных проводилось с использованием дисперсионного анализа. Выживаемость определялась как время от операции до смерти по любой причине. Время до рецидива определялось как время от операции до документированного прогрессирования заболевания или смерти от рака.Послеоперационная выживаемость и выживаемость без рецидивов были проанализированы с использованием метода Каплана-Мейера (тест Мантела-Кокса) с полностью удаленными 120 пациентами, а различия между группами оценивались с помощью лог-рангового теста.

Prism 5 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) использовалась для выполнения статистических расчетов. Анализ прогностических факторов проводился с использованием модели пропорциональных рисков Кокса с помощью Prism 5, а коэффициент ранговой корреляции Спирмена анализировался с помощью Prism 5.Различия считались статистически значимыми, если значение P было <0,05.

Сайтов-cubcadet-Site

]]>

Если у вас возникнут проблемы с доступом к этому веб-сайту, позвоните нам по телефону 1-877-428-2349 для получения помощи.

Двигатель. Заявление об отказе от ответственности: Информация о мощности двигателя в лошадиных силах предоставлена производителем двигателя для использования только в целях сравнения. За подробностями гарантии обращайтесь к местному дилеру Cub Cadet. Заявление об ограничении ответственности: Цена указана в долларах США и является рекомендованной производителем продажной ценой. Модели и цены могут отличаться в зависимости от региона. Налоги, фрахт, установка и доставка не включены. Дополнительное оборудование, аксессуары и насадки продаются отдельно. За подробностями обращайтесь к вашему продавцу. Изображение Заявление об отказе от ответственности: Продукты могут отличаться от изображенной на изображении модели по дизайну, необходимым насадкам, функциям безопасности и нефункциональному внешнему виду, а также могут не отражать инвентарь дилера или технические характеристики устройства. Технические характеристики Заявление об отказе от ответственности: Технические характеристики могут быть изменены без предварительного уведомления. Изображения могут не отражать инвентарь продавца и / или технические характеристики устройства. Руководство оператора Заявление об отказе от ответственности: Размещенное руководство оператора предназначено для общей информации и использования. Чтобы обеспечить загрузку руководства оператора, относящегося к вашему устройству, нам требуются модель и серийный номер. Заявление об ограничении ответственности: Фактическая скорость автомобиля зависит от нагрузки, использования и условий окружающей среды. Заявление об отказе от ответственности: Характеристики аккумулятора и устройства с батарейным питанием зависят от нагрузки, использования и условий окружающей среды. Заявление об отказе от ответственности в отношении программного обеспечения: Программное обеспечение, доступное на веб-сайтах Компании, предоставляется на условиях «как есть» без каких-либо гарантий, явных или подразумеваемых. Пользователь загружает и использует любое программное обеспечение на свой страх и риск. Профессиональные продукты: Коммерческие продукты Cub Cadet предназначены для профессионального использования. UTV: Cub Cadet Utility Vehicles (UTV) предназначены для использования на бездорожье только взрослыми. Пожалуйста, см. Руководство оператора и предупреждающие таблички, размещенные на самом транспортном средстве, для получения более подробной информации. Электронная почта: Подпишитесь, чтобы получать сообщения об услугах, продуктах и специальных предложениях. Вы можете отменить подписку в любое время. Пожалуйста, обратитесь к нашей Политике конфиденциальности.

* По сравнению с тем же двигателем без функции IntelliPower ™, улучшения различаются в зависимости от модели двигателя и конкретных условий эксплуатации.

* Уровень звука по шкале А согласно ISO-5395-1, достоверность 95% при сравнении XT1 Enduro Series LT42, Ultima ZT1 42 и CC30. *

Отсутствие хемокинового лиганда 2 CC не ограничивает инфильтрацию макрофагов в жировую ткань, связанную с ожирением

Abstract

Рекрутирование макрофагов в жировую ткань при ожирении способствует усилению воспалительной активности жировой ткани и, таким образом, может лежать в основе метаболической дисфункции, связанной с ожирением.В жировой ткани повышается содержание хемокинового лиганда 2 CC (CCL2 или моноцитарный хемоаттрактантный белок-1), важного фактора рекрутирования макрофагов. Поэтому мы предположили, что повышенный уровень CCL2 может способствовать привлечению макрофагов жировой ткани, ассоциированным с ожирением. Шестинедельные самцы CCL2 ^{— / —} и мыши дикого типа ( n = 11–14 на группу) получали стандартную диету с высоким содержанием жиров до возраста 34 недель. В возрасте 12–16 и 25–29 недель брали кровь для измерения уровня глюкозы в плазме и гормонов, а также проводили тесты на толерантность к глюкозе и толерантность к инсулину.Жировую ткань собирали через 34 недели для анализа инфильтрации макрофагами. Неожиданно оказалось, что мыши CCL2 ^{— / —} на диете с высоким содержанием жиров не показали снижения макрофагов жировой ткани. Мыши CCL2 ^{— / —} на стандартной диете и диете с высоким содержанием жиров также имели непереносимость глюкозы и имели слегка повышенный уровень глюкозы в плазме и пониженные уровни адипонектина в сыворотке по сравнению с мышами дикого типа. На диете с высоким содержанием жиров мыши CCL2 ^{— / —} также набрали немного больше веса и имели гиперинсулинемию по сравнению с мышами дикого типа.Поскольку уровни макрофагов не изменились у мышей CCL2 ^{— / —}, фенотип, по-видимому, вызван отсутствием самого CCL2. Тот факт, что метаболическая функция была изменена у мышей CCL2 ^{— / —}, несмотря на отсутствие изменений в уровнях макрофагов жировой ткани, предполагает, что CCL2 оказывает влияние на метаболизм, которое не зависит от его способности рекрутировать макрофаги. Важно отметить, что мы пришли к выводу, что CCL2 не является критическим для рекрутирования макрофагов жировой ткани. Таким образом, доминирующий фактор рекрутирования макрофагов в жировую ткань во время ожирения еще предстоит определить.

CCL, CC-хемокиновый лиганд
CCR, CC-хемокиновый рецептор
FACS, флюоресцентно-активируемая сортировка клеток
HIF-1α, индуцируемый гипоксией фактор-1α
IL, интерлейкин
ITT, тест на толерантность к инсулину
KRH, HEPES Кребса-Рингера
MCP, хемоаттрактантный белок моноцитов
SOCS-3, супрессор передачи сигналов цитокинов-3
TNF-α, фактор некроза опухоли-α

Фактором, который может быть важным для инфильтрации макрофагов в жир, является хемокиновый CC-хемокиновый лиганд 2 (CCL2, или хемоаттрактантный белок моноцитов [MCP] -1). CCL2 имеет решающее значение для рекрутирования макрофагов при нескольких воспалительных состояниях (17–21). Более того, его уровни в жировой ткани и плазме сильно повышены при ожирении (15,22–24). Недавние исследования показали, что у тучных мышей с дефицитом CCL2 (25) или его рецептора CC Chemokine рецептора 2 (CCR2) (26) уменьшилась инфильтрация макрофагами жировой ткани и улучшилась метаболическая функция.Напротив, мыши со сверхэкспрессией CCL2 в жире демонстрируют противоположный фенотип (25,27). В текущем исследовании мы также исследовали CCL2 ^{— / —} мышей, чтобы изучить роль CCL2 в рекрутинге макрофагов и метаболической функции. Неожиданно оказалось, что мыши CCL2 ^{— / —} на диете с высоким содержанием жиров не показали какого-либо снижения количества макрофагов жировой ткани. Более того, отсутствие CCL2 у мышей на стандартной диете и рационе с высоким содержанием жиров не улучшало метаболический контроль, а даже, по-видимому, ухудшало его. Таким образом, CCL2, по-видимому, не имеет решающего значения для рекрутирования макрофагов при ожирении и может оказывать влияние на метаболизм, которое не зависит от его способности рекрутировать макрофаги.

РАЗРАБОТКА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Самцов CCL2 ^{— / —} и мышей дикого типа на фоне C57BL / 6J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) содержали от двух до четырех на клетку и содержали при 14/10. -h цикл свет / темнота. Мы поместили 6-недельных мышей ( n = 11–14 на группу) на стандартную диету (диета для грызунов № 8664, 4,05 ккал / г, 17,4% жира ккал; Harlan Teklad, Madison, WI) или с высоким содержанием жиров. диета (№ D12331, 5,56 ккал / г, 58% ккал жира; Research Diets, Нью-Брансуик, Нью-Джерси). Все группы, независимо от диеты, потребляли одинаковую калорийность (~ 14 ккал / день).В возрасте 12 недель измеряли уровни глюкозы, инсулина, лептина и адипонектина натощак. Затем те же животные прошли тесты на толерантность к глюкозе через 14 недель (глюкоза в дозе 1,5 мг / г массы тела внутрибрюшинно после ночного голодания) и тесты на толерантность к инсулину (ITT) через 16 недель (Хумулин R, 1 мЕд / г массы тела внутрибрюшинно через 4 часа. быстро; Эли Лилли, Индианаполис, Индиана). Глюкоза и гормоны натощак, тесты на толерантность к глюкозе и ITT были снова выполнены в возрасте 25, 27 и 29 недель соответственно. Чувствительность к инсулину также оценивалась с помощью модели гомеостаза инсулинорезистентности, которая рассчитывалась путем умножения уровней инсулина натощак (мкл / мл) на уровни глюкозы натощак (ммоль / л), разделенные на 22.5. На 23 неделе состав жира определяли с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (MEC Lunar, Minster, OH). Все процедуры были одобрены комитетом по уходу и использованию животных Медицинского центра Beth Israel Deaconess.

Забор жировой ткани.

В возрасте 34 недель мышей умерщвляли вдыханием CO ₂ и собирали жировые отложения. Мы поместили 0,4–1,2 г перигонадального и подкожного жира в буфер Кребса-Рингера HEPES (KRH), содержащий 10 мг / мл бедного жирными кислотами БСА (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) для выделения адипоцитов и стромальных сосудистых клеток. Часть перигонадного жира была мгновенно заморожена для анализа РНК. Образцы перигонадного и подкожного жира также помещали в фиксатор цинкового формалина для иммуногистохимического анализа.

Выделение адипоцитов и стромальных сосудистых клеток из жировой ткани.

Жировую ткань в буфере KRH измельчали и центрифугировали для удаления клеток крови. Затем его переваривали в 0,12 единиц / мл низкоэндотоксиновой коллагеназы (Liberase 3; Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана) путем встряхивания (80 Гц) при 37 ° C в течение 45 минут.Образцы фильтровали через нейлоновую сетку 300 мкм (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA), и полученную суспензию центрифугировали при 500 g в течение 10 минут для отделения стромальных сосудистых клеток от адипоцитов. Адипоциты хранили в фенол-гуанидинтиоцианатном реагенте (Qiagen, Valencia, CA) при -80 ° C для последующего выделения РНК. Клетки стромальных сосудов инкубировали в буфере для лизиса эритроцитов (0,154 ммоль / л NH ₄ Cl, 10 ммоль / л KHCO ₃, 0,1 ммоль / л ЭДТА) в течение 2 минут, а затем промывали KRH-BSA.Затем клетки суспендировали в буфере для сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) (PBS с 5 ммоль / л EDTA и 0,2% бедным жирными кислотами BSA). Часть клеток подсчитывали с помощью гемацитометра. На основании исключения трипанового синего процент живых клеток в образце составлял 70 ± 3 и 70 ± 2% для перигонадальных и подкожных стромальных сосудистых клеток, соответственно. Остальные стромальные сосудистые клетки подвергали FACS-анализу, как описано ниже.

Определение уровней макрофагов в жировой ткани и выделение макрофагов из стромальных сосудистых клеток с помощью FACS.

Клетки стромальных сосудов инкубировали в темноте на шейкере с FcBlock (20 мкг / мл; BD Pharmingen, San Jose, CA) в течение 30 мин при 4 ° C. Клетки перигонадных стромальных сосудов инкубировали в течение 50 мин с аллофикоцианином-конъюгированным антителом F4 / 80 (5 мкг / мл) и конъюгированным с фикоэритрином антителом к CD11b (Mac1) (2 мкг / мл; Caltag Laboratories, Burlingame, CA), оба маркера клеточной поверхности. зрелых макрофагов, которые не обнаруживаются на преадипоцитах (27,28). Клетки подкожных стромальных сосудов инкубировали только с антителом F4 / 80.После инкубации клетки промывали буфером FACS. Сосудистые клетки перигонадной стромы были разделены на популяции F4 / 80-положительных, CD11b-положительных, F4 / 80 / CD11b и дважды отрицательных F4 / 80 / CD11b с помощью сортировщика клеток MoFlo (Dako Cytomation, Fort Collins, CO). . Программное обеспечение Summit версии 4 (Dako Cytomation) использовалось для определения процентного содержания клеточных популяций в стромальной сосудистой фракции. Клетки F4 / 80 / CD11b ^{+ / +} и F4 / 80 / CD11b ^{— / —} хранили в фенол-гуанидинтиоцианатном реагенте (Центр молекулярных исследований, Цинциннати, Огайо) при -80 ° C для последующего выделения РНК.Клетки подкожных стромальных сосудов фиксировали в 4% параформальдегиде в PBS, и процент F4 / 80-положительных клеток определяли с помощью аппарата FACSCalibur и программного обеспечения CellQuest (BD, Franklin Lakes, NJ). Мы оценили количество макрофагов на депо по следующей формуле: количество F4 / 80-положительных клеток на депо =% F4 / 80-положительных клеток в стромальной сосудистой фракции × количество живых клеток стромальной сосудистой фракции, выделенных на грамм жировой ткани. × масса депо в граммах.Для перигонадальных стромальных сосудистых клеток мы использовали комбинированный процент клеток F4 / 80 ⁺, CD11b ⁺ и F4 / 80 / CD11b ^{+ / +} для определения количества макрофагов в перигонадальной жировой ткани.

ОТ-ПЦР на РНК жировой ткани, адипоцитов и стромальных сосудистых клеток.

Тотальную РНК выделяли из цельной перигонадной жировой ткани, адипоцитов, клеток F4 / 80 / CD11b ^{+ / +} и клеток F4 / 80 / CD11b ^{— / —}, а затем обратно транскрибировали в кДНК (Retroscipt; Ambion, Остин, Техас).Затем была проведена ОТ-ПЦР TaqMan (Applied Biosystems, Branchburg, NJ) для измерения мРНК маркеров макрофагов F4 / 80, CD11b и CD68, а также TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-10. , iNOS, супрессор передачи сигналов цитокинов 3 (SOCS-3) и индуцируемый гипоксией фактор-1α (HIF-1α). Относительные уровни экспрессии мРНК определяли с использованием стандартных кривых. Образцы были скорректированы по общему содержанию РНК по сравнению с экспрессией циклофилина или 18S. По запросу могут быть предоставлены последовательности TNF-α, IL-1β, iNOS, SOCS-3, циклофилина и 18S (Invitrogen, Carlsbad, CA) и зонда (Biosearch Technologies, Novato, CA).Для остальных генов использовали смеси праймер-зонд от Applied Biosystems.

Иммуногистохимия жировой ткани.

Парафиновые срезы жировой ткани анализировали на содержание макрофагов путем окрашивания антителом против F4 / 80. Срезы подвергали извлечению трипсинового антигена с последующим блокированием авидином, биотином (Vector Laboratories, Burlingame, CA) и кроличьей сывороткой. Затем срезы инкубировали с крысиным антителом против мышиного F4 / 80 (1:75; Serotec, Raleigh, NC) в течение ночи при 4 ° C.Окрашивание F4 / 80 определяли путем инкубации слайдов с биотинилированным кроличьим антителом против крысы с последующей обработкой конъюгированным с пероксидазой стрептавидином (Vector Laboratories) и 3-амино-9-этилкарбазолом (Dako, Carpinteria, CA). Предметные стекла контрастировали гематоксилином. Для определения инфильтрации макрофагов анализировали два поля с увеличением в 10 раз из каждого из двух срезов жировой ткани на мышь. Процент макрофагов определяли путем подсчета количества ядер F4 / 80-положительных клеток по отношению к общему количеству ядер клеток на поле.

Измерения сыворотки и плазмы.

Концентрации инсулина в сыворотке (CrystalChem, Downers Grove, IL), лептина (CrystalChem), адипонектина (Linco Research, St. Charles, MO) и CCL7 (Bender MedSystems, Burlingame, CA) определяли с помощью иммуноферментного анализа. Уровни CCL2 в сыворотке измеряли с помощью набора LincoPlex в сыворотке мышей (Linco Research). Уровни глюкозы в плазме измеряли с помощью глюкометра (Lifescan, Milpitas, CA).

Статистический анализ.

Данные представляют собой средние значения ± SE.Измерения анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Дункана для множественных сравнений. Значимость была установлена на уровне P <0,05. Статистический анализ был выполнен с помощью программного обеспечения Statistica (Statsoft, Tulsa, OK).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Уровни CCL2 и CCL7 в сыворотке повышены у мышей дикого типа на диете с высоким содержанием жиров, но не обнаруживаются у мышей CCL2

^{— / —}

У мышей дикого типа на диете с высоким содержанием жиров заметно увеличились ( P <0,001) уровни CCL2 в сыворотке по сравнению с мышами на стандартной диете (39 ± 11 пг / мл, n = 9 и 167 ± 34 пг / мл). ml, n = 9, для стандартной диеты и диеты с высоким содержанием жиров соответственно).CCL2 был очень низким или не определялся у мышей CCL2 ^{— / —} на любой диете (0 пг / мл, n = 8 и 4,0 ± 4,0 пг / мл, n = 9, соответственно). Чтобы исключить, может ли компенсаторное увеличение других лигандов CCR2 происходить у мышей CCL2 ^{— / —}, мы измерили сывороточные уровни другого лиганда CCR2, CCL7 (MCP-3). CCL7 также был повышен ( P <0,001) у мышей дикого типа, получавших диету с высоким содержанием жиров (1,3 ± 0,7 пг / мл, n, = 11 и 15,7 ± 4,3 пг / мл, n = 11, для стандартной и жирной диеты соответственно).Удивительно, но CCL7 также не обнаруживался у мышей CCL2 ^{— / —} (0 пг / мл, n = 10 и 0 пг / мл, n = 12, для стандартной диеты и диеты с высоким содержанием жиров, соответственно), что позволяет предположить что уровни CCL7 могут регулироваться CCL2.

CCL2

^{— / —}

Неожиданно мыши CCL2 ^{— / —} набрали больше веса на диете с высоким содержанием жиров, чем мыши дикого типа ( P <0.05) (Рис.1 A ). В возрасте от 18 до 34 недель мыши CCL2 ^{— / —} весили в среднем на 13% больше, чем мыши дикого типа, получавшие пищу с высоким содержанием жиров. Это было связано с 15% увеличением процентного содержания жира в организме и веса жировых подушечек и повышенными уровнями лептина в сыворотке ( P <0,05) (Рис. 1 C — E ). Безжировая масса не изменилась (данные не показаны). Мыши CCL2 ^{— / —} на стандартной диете весили немного меньше, чем мыши дикого типа ( P <0,05 для некоторых возрастов) (рис.1 В ). Однако не было различий в содержании жира, лептина сыворотки и безжировой массе. Потребление пищи мышами CCL2 ^{— / —} на высокожировой и стандартной диете не отличалось от мышей дикого типа (данные не показаны).

Отсутствие CCL2 не ограничивает инфильтрацию макрофагов в жировую ткань.

Иммуногистохимический анализ перигонадальной жировой ткани, окрашенной антителом против маркера макрофагов F4 / 80, показал, что диета с высоким содержанием жиров у мышей дикого типа индуцировала пятикратное увеличение процента макрофагов (рис.2 A , C и E ). Уровни информационной РНК маркеров макрофагов F4 / 80, CD11b и CD68 также повышались ( P <0,05) после диеты с высоким содержанием жиров (таблица 1). По данным FACS, наблюдалось небольшое увеличение ( P <0,05) процента макрофагов в стромальной сосудистой фракции (рис. 2 F ) и пятикратное увеличение ( P <0,05) количества макрофагов на депо в мышей, получавших пищу с высоким содержанием жиров (рис. 2 G ).

Неожиданно оказалось, что мыши CCL2 ^{— / —}, получавшие диету с высоким содержанием жиров, не показали никакого снижения процента макрофагов в жировой ткани, окрашенных на F4 / 80 (рис.2 D и E ). Было даже очень слабое, но значительное ( P <0,05) увеличение процента макрофагов. По данным FACS, процент макрофагов в стромальной сосудистой фракции был аналогичен мышам дикого типа (фиг. 2 F ). Однако количество макрофагов на депо также слегка увеличилось ( P <0,05) (фиг. 2 G ). Частично это может быть связано с увеличенным размером перигонадного депо у мышей CCL2 ^{— / —} на диете с высоким содержанием жиров.Тем не менее, ОТ-ПЦР для мРНК F4180, CD11b и CD68 не показала различий между мышами дикого типа и CCL2 ^{— / —} на диете с высоким содержанием жиров (таблица 1). Взятые вместе, данные показывают, что отсутствие CCL2 не снижает инфильтрацию макрофагов в жировую ткань, связанную с ожирением. У мышей CCL2 ^{— / —} на стандартной диете количество макрофагов и уровни мРНК маркеров макрофагов также не отличались от таковых у мышей дикого типа (фиг. 2 B и E — G , таблица 1).Количество макрофагов также не изменилось в подкожно-жировой клетчатке мышей CCL2 ^{— / —} (не показано).

Отсутствие CCL2 не улучшает метаболическую функцию.

Отсутствие CCL2 не улучшало метаболическую функцию у мышей CCL2 ^{— / —}, получавших любую диету. Неожиданно оказалось, что метаболический контроль даже немного ухудшился у мышей CCL2 ^{— / —}. В возрасте 14 и 27 недель мыши CCL2 ^{— / —} на обоих диетах имели непереносимость глюкозы по сравнению с мышами дикого типа ( P <0.05) (Рис.3 A — D ). Непереносимость глюкозы ухудшалась с возрастом у мышей CCL2 ^{— / —} на стандартной диете. На 27 неделе пиковые уровни глюкозы у мышей CCL2 ^{— / —}, получавших стандартную диету, были на 6 ммоль / л выше, чем у мышей дикого типа. Для мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров, разница в толерантности к глюкозе на 27 неделе была меньше, чем на 14 неделе из-за ухудшенной толерантности к глюкозе у мышей дикого типа. CCL2 ^{— / —} мышей на стандартной диете и диете с высоким содержанием жиров также показали умеренное увеличение ( P <0.05) уровня глюкозы натощак и снижения ( P <0,05) сывороточного адипонектина (рис. 3 E и F ). Уровни инсулина натощак и значения для оценки инсулинорезистентности на модели гомеостаза у мышей CCL2 ^{— / —}, получавших пищу с высоким содержанием жиров, были почти вдвое выше, чем уровни дикого типа ( P <0,05) (рис. 4 A и B ), предполагая, что отсутствие CCL2 ухудшает инсулинорезистентность, связанную с ожирением. Однако эти результаты неубедительны, поскольку чувствительность к инсулину по оценке ITT не различалась (рис.4 C и D ).

Отсутствие CCL2 не изменяет экспрессию мРНК маркера воспаления во всей жировой ткани.

Мы также исследовали влияние ожирения и отсутствия CCL2 на мРНК маркера воспаления жировой ткани. Как и в случае мРНК маркера макрофагов, уровни мРНК перигонадального TNF-α были низкими как у мышей дикого типа, так и у мышей CCL2 ^{— / —} на стандартной диете и увеличивались аналогичным образом в ответ на диету с высоким содержанием жиров (стандартная диета дикого типа: 0,45 ± 0,03 , n = 12; CCL2 ^{— / —} стандартный рацион: 0.42 ± 0,04, n = 10; диета дикого типа с высоким содержанием жиров: 0,95 ± 0,07, n = 12; CCL2 ^{— / —} диета с высоким содержанием жиров: 1,03 ± 0,06, n = 10; Экспрессия TNF / циклофилина; P <0,001 по сравнению со стандартной диетой). У мышей дикого типа и CCL2 ^{— / —} диета с высоким содержанием жиров также приводила к аналогичному увеличению мРНК CCR2, указывая на то, что отсутствие CCL2 не приводило к компенсаторному увеличению экспрессии его рецептора (стандартная диета дикого типа: 0,62 ± 0,04, n = 12; CCL2 ^{— / —} стандартный рацион: 0.49 ± 0,02, n = 11; диета дикого типа с высоким содержанием жиров: 0,86 ± 0,06, n = 12; CCL2 ^{— / —} диета с высоким содержанием жиров: 0,79 ± 0,06, n = 12; Экспрессия CCR2 / циклофилина; P <0,05, диета с высоким содержанием жиров по сравнению со стандартной диетой). Это открытие, в сочетании со сниженными уровнями CCL7 в сыворотке у мышей CCL2 ^{— / —}, предполагает, что фенотип мышей CCL2 ^{— / —} вряд ли был вызван усилением передачи сигналов другими лигандами CCR2. Не было никакого влияния диеты с высоким содержанием жиров или отсутствия CCL2 на уровни мРНК IL-6, IL-1β, iNOS и SOCS-3 (данные не показаны).

Отсутствие CCL2 изменяет экспрессию воспалительного гена в клетках жировой ткани.

Мы также исследовали влияние диеты с высоким содержанием жиров и отсутствия CCL2 на экспрессию воспалительных маркеров в адипоцитах, макрофагах (F4 / 80 и CD11b ^{+ / +} клетки) и немакрофагальных стромальных сосудистых клетках (F4 / 80 и CD11b ^{). — / —} клеток), выделенных методом FACS. У мышей дикого типа на стандартной диете мРНК F4 / 80 была в основном ограничена фракцией макрофагов (фиг. 5 A ). МРНК TNF-α, IL-1β и IL-10 также были самыми высокими ( P <0.05) в макрофагах (Фиг.5 B — D ). Диета с высоким содержанием жиров у мышей дикого типа увеличивала ( P <0,05) мРНК TNF-α в адипоцитах и мРНК IL-1β и -10 в адипоцитах и немакрофагальных стромальных сосудистых клетках. Неожиданно мРНК F4 / 80 также была увеличена ( P <0,05) в адипоцитах с ожирением. Возможно, это связано с остаточными макрофагами во фракции адипоцитов. Уровни мРНК TNF-α и IL-10 в адипоцитах с ожирением сильно коррелировали с экспрессией F4 / 80 (TNF-α vs.F4 / 80, R ² = 0,78, P <0,05; IL-10 против F4 / 80, R ² = 0,78, P <0,05), что позволяет предположить, что остаточные макрофаги способствовали увеличению мРНК адипоцитов TNF-α и IL-10. Напротив, уровни мРНК адипоцитов IL-1β и F4 / 80 существенно не коррелировали ( R ² = 0,44, P = NS), что позволяет предположить, что увеличение мРНК IL-1β могло быть специфичным для адипоцитов.

Ожирение у мышей дикого типа увеличилось ( P <0.05) мРНК макрофага F4 / 80, что, возможно, указывает на повышенную активность макрофагов. Ожирение также увеличивало ( P <0,05) мРНК IL-6 в немакрофагальных стромальных сосудистых клетках и мРНК SOCS-3 в макрофагах, но оно уменьшало ( P <0,05) мРНК SOCS-3 в адипоцитах (рис. 5 E ). и F ). Информационная РНК для HIF-1α, регулятора клеточного ответа на гипоксию, который повышается в жировой ткани у людей с ожирением (13), была увеличена ( P, <0,05) в немакрофагальных стромальных сосудистых клетках, но снизилась ( P <0.05) в адипоцитах в ответ на диету с высоким содержанием жиров (рис. 5 G ).

CCL2 ^{— / —} мышей на стандартной диете имели более высокие ( P <0,05) уровни мРНК TNF-α и IL-10 во всех популяциях клеток по сравнению с их аналогами дикого типа. Экспрессия мРНК IL-1β была выше ( P <0,05) в адипоцитах и немакрофагальных стромальных сосудистых клетках и выше ( P <0,05) мРНК IL-6 и HIF-1α в адипоцитах, но была ниже ( P <0.05) мРНК SOCS-3 в адипоцитах. Хотя эти данные контрастируют с аналогичными уровнями мРНК воспалительного гена во всей жировой ткани, они предполагают, что могло наблюдаться некоторое усиление воспалительной активности в жировой ткани мышей CCL2 ^{— / —} на стандартной диете. У мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров, дефицит CCL2 усиливал ( P <0,05) связанное с ожирением увеличение мРНК макрофагов F4 / 80 и SOCS-3 и немакрофагальных стромальных сосудистых клеток IL-10 и мРНК HIF-1α. Однако уровни мРНК адипоцитов TNF-α и IL-1β у мышей CCL2 ^{— / —} с пищей с высоким содержанием жиров были ниже ( P <0.05), чем у мышей дикого типа. Уровень мРНК F4 / 80 адипоцитов также был ниже, что позволяет предположить, что снижение уровней мРНК TNF-α и IL-1β могло быть вызвано присутствием меньшего количества остаточных макрофагов во фракции адипоцитов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ожирение связано с повышенной инфильтрацией макрофагами жировой ткани (12–16). Более того, есть данные, позволяющие предположить, что макрофаги могут быть в значительной степени ответственны за усиление воспалительной активности ожирения жировой ткани (12,15). Механизмы, лежащие в основе рекрутирования макрофагов в жировую ткань, неизвестны.Хемокин CCL2 является критическим хемоаттрактантом для макрофагов в нескольких воспалительных моделях (17–21). При ожирении уровни CCL2 в сыворотке и жировой ткани заметно повышены (15,22–24), что указывает на то, что CCL2 может быть важным фактором рекрутирования макрофагов.

Мы изучали мышей с дефицитом CCL2, чтобы изучить роль CCL2 в рекрутинге макрофагов и метаболической функции. Удивительно, но, несмотря на почти неопределяемые уровни CCL2 в сыворотке, иммуногистохимический и FACS-анализ жировой ткани показал, что у мышей CCL2 ^{— / —} на стандартной диете и рационе с высоким содержанием жиров не было сниженного количества макрофагов по сравнению с мышами дикого типа.ОТ-ПЦР также показала идентичное повышение экспрессии генов жировой ткани макрофаговых маркеров F4 / 80, CD11b и CD68 у мышей CCL2 ^{— / —} и мышей дикого типа после диеты с высоким содержанием жиров. Наши результаты контрастируют с недавними сообщениями об уменьшении количества макрофагов жировой ткани у мышей CCL2 ^{— / —} (25) и CCR2 ^{— / —} (26) C57BL / 6J с ожирением. Примечательно, однако, что уменьшение количества макрофагов в этих исследованиях было небольшим. По данным иммуногистохимии, доля макрофагов в перигонадном жире снизилась только на 20–30% (25,26).Более того, другое исследование на мышах CCR2 ^{— / —}, получавших диету с высоким содержанием жиров и на фоне DBA1 / J, не показало уменьшения макрофагов жировой ткани (30). На момент сбора ткани наши мыши были всего на несколько недель старше ранее изученных мышей CCL2 ^{— / —} и CCR2 ^{— / —} (25, 26). Таким образом, маловероятно, что тот факт, что мы собирали жировую ткань в возрасте 34 недель, был причиной отсутствия снижения количества макрофагов у наших мышей.

Трансгенные мыши, сверхэкспрессирующие CCL2 в жировой ткани, также были изучены (25,27).В одном исследовании у трансгенных мышей CCL2 уровень CCL2 в сыворотке был почти вдвое выше, чем у мышей дикого типа на диете с высоким содержанием жиров, но у них было на 40% меньше макрофагов в жире (25). У других трансгенных мышей CCL2 уровень CCL2 в плазме был в 2,5 раза выше, чем у мышей дикого типа, но только на 25% больше макрофагов (27). Эти и наши данные предполагают, что CCL2 не может быть основным фактором рекрутирования макрофагов в ожирение жировой ткани. Хотя CCL2 является важным фактором рекрутирования макрофагов при некоторых воспалительных состояниях (18–21), существуют обстоятельства, при которых CCL2 повышен, но не способствует рекрутированию макрофагов (31,32).Например, инфильтрация макрофагов в раны с кожными надрезами не снижается у мышей CCL2 ^{— / —}, даже несмотря на то, что уровни CCL2 на участках ран высоки у нормальных животных (31). Учитывая умеренное влияние отсутствия CCL2 на макрофаги жировой ткани в предыдущих исследованиях, возможно, что различия в экспериментальных условиях внесли свой вклад в расхождения между нашими выводами. В более раннем исследовании CCL2 ^{— / —} и мыши дикого типа были из разных колоний (25). Мы изучили тех же мышей CCL2 ^{— / —}, которые использовались в предыдущем исследовании (25).Однако в качестве контроля мы использовали мышей дикого типа из колонии, с которой были скрещены наши мыши CCL2 ^{— / —}. Вариации генетического фона из-за того, что они происходят из разных колоний, возможно, внесли свой вклад в различия между мышами дикого типа и мышами CCL2 ^{— / —} в более раннем исследовании. Что касается мышей CCR2 ^{— / —}, нельзя исключать, что фенотип у мышей CCR2 ^{— / —} также был связан со сниженным действием других лигандов CCR2 CCL7 (MCP-3) (33), CCL8 (MCP-2) (34), CCL12 (MCP-5) (35) и CCL13 (MCP-4) (36).

Отсутствие CCL2 не улучшило метаболическую функцию и, как ни странно, несколько ухудшило ее. У мышей CCL2 ^{— / —}, получавших диету с высоким содержанием жиров, наблюдалось незначительное увеличение телесного жира и более высокие уровни инсулина в сыворотке, чем у мышей дикого типа. Повышенное ожирение могло быть следствием отсутствия CCL2 для усиления роста жировой ткани. Интересно, что у мышей CCR2 ^{— / —} с ожирением, изученных ранее, были более крупные адипоциты (25). Более ранние отчеты также показали, что CCL2 индуцирует дедифференцировку адипоцитов в адипоцитах 3T3-L1 за счет снижения содержания триглицеридов и экспрессии генов, экспрессируемых в зрелых адипоцитах, таких как липопротеинлипаза, адипсин, GLUT-4, aP2, β3-адренергический рецептор и пролифератор пероксисом. рецептор-γ (24,37).Неожиданно оказалось, что мыши CCL2 ^{— / —}, соблюдающие стандартную диету с высоким содержанием жиров, также страдали непереносимостью глюкозы и имели слегка повышенный уровень глюкозы. Учитывая, что количество макрофагов не изменилось, этот фенотип, по-видимому, был вызван отсутствием самого CCL2. Предыдущие исследования показали неизменную метаболическую функцию у худых мышей CCL2 ^{— / —} и CCR2 ^{— / —} и улучшение толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину у мышей CCL2 ^{— / —} и CCR2 ^{— / —} на диете с высоким содержанием жиров ( 25,26).Как упоминалось выше, эти отличия от наших данных могли быть связаны с фоновыми вариациями у мышей CCL2 ^{— / —} и дикого типа, использованных в более раннем исследовании, а также с потерей действия других лигандов CCR2 в CCR2 ^{— / —} мышей. Тем не менее, наши результаты также контрастируют с непереносимостью глюкозы и инсулинорезистентностью, наблюдаемой у мышей со сверхэкспрессией CCL2 в жире под промотором ap2 (25,27). Причина ухудшения регуляции метаболизма у наших животных неизвестна. Однако следует отметить, что дефицит CCL2 оказывает комплексное влияние на иммунную функцию, вызывая как повышающую, так и понижающую регуляцию воспалительных факторов (32,38,39).У мышей, получавших эндотоксин, нейтрализация CCL2 увеличивает сывороточные уровни TNF-α и IL-12 (39), а у CCL2 ^{— / —} или CCL2-нейтрализованных мышей другие обнаружили более высокие уровни TNF-α и IL-10. (32,38). В выделенных нами адипоцитах, макрофагах и немакрофагальных стромальных сосудистых клетках из жировой ткани худых и страдающих ожирением мышей CCL2 ^{— / —} наблюдалось некоторое усиление экспрессии воспалительных генов. Хотя это не привело к повышенной экспрессии воспалительных генов во всей ткани, мы не можем исключить, что повышенная воспалительная активность в жире или где-либо еще могла способствовать дефектам у наших мышей.

Поскольку CCR2 имеет несколько лигандов, мы исследовали, были ли метаболические дефекты у наших мышей CCL2 ^{— / —} вызваны компенсаторным увеличением других хемокинов, которые действуют на CCR2, или увеличением самого CCR2. Мы не наблюдали увеличения мРНК CCL7 в сыворотке или CCR2 жировой ткани у мышей CCL2 ^{— / —}. Фактически, сывороточный CCL7 у этих животных не определялся. В согласии с этим, предыдущее исследование на мышах CCL2 ^{— / —} сообщило о 50% снижении уровней мРНК CCL7 и CCL2 в почках (21).Снижение экспрессии CCL7, по-видимому, не связано с непреднамеренным нацеливанием на CCL7 во время генерации мышей CCL2 ^{— / —} (18). Таким образом, ухудшение метаболического контроля у мышей CCL2 ^{— / —} вряд ли было вызвано компенсаторным увеличением CCL7 и других лигандов CCR2 или повышенной чувствительностью к этим лигандам из-за повышенной экспрессии CCR2.

В дополнение к изучению роли CCL2 в привлечении макрофагов, связанных с ожирением, мы исследовали вклад различных популяций клеток жировой ткани в воспалительную активность жировой ткани.Имеющиеся данные позволяют предположить, что макрофаги являются основным источником воспалительных цитокинов жировой ткани, таких как TNF-α и iNOS (12). У мышей, соблюдающих стандартную диету, мы обнаружили, что мРНК TNF-α, IL-1β и IL-10 наиболее заметно экспрессируются во фракции макрофагов, что позволяет предположить, что макрофаги могут быть основным источником этих цитокинов. Напротив, мРНК SOCS-3 была самой высокой в адипоцитах, тогда как мРНК IL-6 была самой низкой в макрофагах. Ожирение увеличивало мРНК IL-1β в адипоцитах и мРНК IL-10 и -1β в немакрофагальных стромальных сосудистых клетках.МРНК TNF-α и IL-10 были увеличены в адипоцитах, но неясно, было ли это вызвано присутствием остаточных макрофагов. Уровень мРНК IL-6, SOCS-3 и HIF-1α увеличивался в одних популяциях, но снижался в других. В целом, наши данные предполагают, что повышенная воспалительная активность в жировой ткани вызвана не только повышенной инфильтрацией макрофагов, но также воспалительной активацией клеток жировой ткани.

Таким образом, мы сообщаем, что отсутствие CCL2 не снижает рекрутирование макрофагов, связанных с ожирением, в жировую ткань и не улучшает метаболическую функцию.В этом исследовании отсутствие CCL2, по-видимому, даже немного усугубляет ожирение и вызывает легкую метаболическую дисрегуляцию даже у мышей, получавших диету с низким содержанием жиров, что указывает на то, что CCL2 оказывает влияние на метаболизм, которое не зависит от его способности рекрутировать макрофаги. Хотя CCL2 является важным фактором рекрутирования макрофагов при нескольких воспалительных состояниях (18–21), наши данные и предыдущие отчеты, показывающие незначительный эффект или отсутствие эффекта отсутствия CCL2 или CCR2 на сокращение макрофагов жировой ткани при ожирении (25,26,30), приводят к Мы пришли к выводу, что CCL2 не является критическим для рекрутирования связанных с ожирением макрофагов в жировую ткань.Таким образом, доминирующий фактор втягивания макрофагов в жировую ткань при ожирении еще предстоит определить.

Масса тела для диеты с высоким содержанием жиров (HFD) ( A ) и стандартной (Std) диеты ( B ), процент жира в организме, измеренный с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии в возрасте 23 недель ( C ), перигонадальной (PGWAT), мезентериальной (MES) и периренальной жировой подушке в возрасте 34 недель ( D ), а также уровни лептина в сыворотке натощак ( E ) дикого типа ( n = 12 ) и CCL2 ^{— / —} ( n = 12) мышей, получавших стандартную пищу или диету с высоким содержанием жиров.Значения — это средние значения ± SE. * P <0,05 по сравнению с диким типом; † P <0,05 по сравнению со стандартной диетой того же генотипа.

Перигонадальная жировая ткань дикого типа ( A и C ) и CCL2 ^{— / —} ( B и D ) окрашенные мыши, получавшие стандартную (Std) или высокожировую диету (HFD). с антителом против маркера макрофагов, F4 / 80 (красный), 10-кратное увеличение. Иммуногистохимический анализ фракции F4 / 80-положительных клеток относительно общего количества клеток в перигонадальной жировой ткани (PGWAT) ( E ).FACS-анализ процентного содержания F4 / 80- и / или CD11b-положительных клеток в перигонадальной стромальной сосудистой фракции (SVF) ( F ) и перигонадном депо ( G ). Значения выражены как среднее ± SE. * P <0,05 по сравнению с диким типом; † P <0,05 по сравнению со стандартной диетой того же генотипа.

Тесты на толерантность к глюкозе ( A — D ), уровень глюкозы в плазме натощак ( E ) и уровни адипонектина в сыворотке ( F ) у мышей дикого типа и CCL2 ^{— / —} мышей, получавших стандартное питание (Std. ) ( A и B ) или диета с высоким содержанием жиров (HFD) ( C и D ).Значения — это средние значения ± SE. * P <0,05 по сравнению с диким типом; † P <0,05 по сравнению со стандартной диетой того же генотипа.

Сывороточный инсулин ( A ), оценка модели гомеостаза инсулинорезистентности ( B ) и ITT (в возрасте 16 недель) ( C и D ) у животных дикого типа и CCL2 ^{— / —} мышей получали стандартную (Std) ( C ) или высокожировую диету (HFD) ( D ). Значения — это средние значения ± SE. * P <0,05 vs.дикого типа; † P <0,05 по сравнению со стандартной диетой того же генотипа.

перигонадальных адипоцитов, F4 / 80 / CD11b ^{+ / +} стромальных сосудистых клеток и F4 / 80 / CD11b ^{— / —} экспрессия в стромальных сосудистых клетках F4 / 80 ( A ), TNF-α ( B ), IL-1β ( C ), IL-10 ( D ), IL-6 ( E ), SOCS-3 ( F ) и мРНК HIF-1α ( G ) у мышей дикого типа ( n = 8) и CCL2 ^{— / —} ( n = 8) мышей, получавших стандартную (Std) или высокожировую диету (HFD).Уровни информационной РНК были нормализованы относительно мРНК 18S. Значения — это средние значения ± SE. * P <0,05 по сравнению со стандартной диетой дикого типа; † P <0,05 по сравнению со стандартной диетой CCL2 ^{— / —}; ‡ P <0,05 по сравнению с диетой дикого типа с высоким содержанием жиров; § P <0,05 по сравнению с CCL2 ^{— / —} диета с высоким содержанием жиров; ‖ P <0,05 по сравнению с адипоцитами той же группы; ¶ P <0,05 по сравнению с F4 / 80 / CD11b ^{— / —} стромальных сосудистых клеток той же группы.

Благодарности

Эта работа финансировалась за счет грантов Национальных институтов здравоохранения (J.С.Ф. и Б.Дж.Р.). K.E.I. был поддержан грантом Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады. J.K.H. был поддержан передовой стипендией Wellcome Trust, а компания G.M.L. финансировалась стипендией ученых-клиницистов Совета медицинских исследований.

Мы благодарим И. Конти и Э. Холла за их помощь в этих исследованиях.

Сноски

Опубликованы перед печатью на http://diabetes.diabetesjournals.org 1 мая 2007 г. DOI: 10.2337 / db07-0425.
Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Поэтому данная статья должна быть помечена как «реклама» в соответствии с 18 U.S.C. Раздел 1734 исключительно для указания этого факта.
- Принято 25 апреля 2007 г.
- Получено 27 марта 2007 г.
ДИАБЕТА

ССЫЛКИ

↵
Мокдад АХ, Форд Дитс, Бауман VS, Marks JS: Распространенность ожирения, диабета и факторов риска для здоровья, связанных с ожирением, 2001 г. .JAMA289 : 76 –79,2003
↵
Hubert HB, Feinleib M, McNamara PM, Castelli WP: Ожирение как независимый фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний: 26-летнее наблюдение участников Фрамингемского исследования сердца. Тираж67 : 968 –977,1983
↵
Hotamisligil GS, Arner P, Caro JF, Atkinson RL, Spiegelman BM: Повышенная экспрессия фактора некроза опухоли альфа в жировой ткани при ожирении и инсулинорезистентности человека. J Clin Invest95 : 2409 –2415,1995
↵
Lyon CJ, Law RE, Hsueh WA: Мини-обзор: ожирение, воспаление и атерогенез.Эндокринология144 : 2195 –2200,2003
Sjoholm A, Nystrom T: эндотелиальное воспаление при инсулинорезистентности. Lancet365 : 610 –612,2005
↵
Веллен К.Э., Хотамислигил Г.С.: Воспаление, стресс и диабет. J Clin Invest115 : 1111 –1119,2005
↵
Hotamisligil GS, Shargill NS, Spiegelman BM: Жировая экспрессия фактора некроза опухоли альфа: прямая роль в резистентности к инсулину, связанной с ожирением. Наука259 : 87 –91,1993
↵
Bastard JP, Jardel C, Bruckert E, Blondy P, Capeau J, Laville M, Vidal H, Hainque B: Повышенные уровни интерлейкина 6 снижаются в сыворотке и подкожной жировой ткани у людей с ожирением. женщины после похудания.Дж Клин Эндокринол Метаб85 : 3338 –3342,2000
↵
Porreca E, Di Febbo C, Vitacolonna E, Baccante G, Di Castelnuovo A, Angelini A, Febo F, Di Nisio M, Cuccurullo F: преобразование уровней фактора роста-бета1 у пациентов с гипертонической болезнью : связь с индексом массы тела и лептином. Am J Hypertens15 : 759 –765,2002
↵
Perreault M, Marette A: Целенаправленное нарушение индуцибельной синтазы оксида азота защищает мышцы от инсулинорезистентности, связанной с ожирением.Нат Мед7 : 1138 –1143,2001
↵
Bastard JP, Maachi M, Van Nhieu JT, Jardel C, Bruckert E, Grimaldi A, Robert JJ, Capeau J, Hainque B: Содержание IL-6 в жировой ткани коррелирует с резистентностью к инсулину активация поглощения глюкозы как in vivo, так и in vitro. J Clin Endocrinol Metab87 : 2084 –2089,2002
↵
Weisberg SP, McCann D, Desai M, Rosenbaum M, Leibel RL, Ferrante AW Jr: Ожирение связано с накоплением макрофагов в жировой ткани.J Clin Invest112 : 1796 –1808,2003
↵
Канселло Р., Хенегар С., Вигери Н, Талеб С., Пуату С., Руо С, Купай М, Пеллу V, Хюголь Д., Буйо Дж. Л., Булуми А, Барбателли Дж., Синти Синти Svensson PA, Barsh GS, Zucker JD, Basdevant A, Langin D, Clement K: Уменьшение инфильтрации макрофагов и изменений экспрессии гена хемоаттрактанта в белой жировой ткани субъектов с патологическим ожирением после потери веса, вызванной операцией. Диабет54 : 2277 –2286,2005
Cinti S, Mitchell G, Barbatelli G, Murano I, Ceresi E, Faloia E, Wang S, Greenberg AS, Obin MS: гибель адипоцитов определяет локализацию и функцию макрофагов в жировой ткани мышей с ожирением и люди.J Lipid Res46 : 2347 –2355,2005
↵
Xu H, Barnes GT, Yang Q, Tan G, Yang D, Chou CJ, Sole J, Nichols A, Ross JS, Tartaglia LA, Chen H: Хроническое воспаление жировых отложений играет решающую роль в развитии инсулинорезистентности, связанной с ожирением. J Clin Invest112 : 1821 –1830,2003
↵
Кузен Б., Андре М., Кастейла Л., Пенико Л.: Измененные макрофагоподобные функции преадипоцитов при воспалении и генетическом ожирении. J Cell Physiol186 : 380 –386,2001
↵
Gunn MD, Nelken NA, Liao X, Williams LT: Моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 достаточен для хемотаксиса моноцитов и лимфоцитов у трансгенных мышей, но требует дополнительного стимула для воспалительной активации.Дж Иммунол158 : 376 –383,1997
↵
Lu B, Rutledge BJ, Gu L, Fiorillo J, Lukacs NW, Kunkel SL, North R, Gerard C, Rollins BJ: Нарушения рекрутирования моноцитов и экспрессии цитокинов в хемоаттрактантном белке моноцитов 1 -дефицитные мыши. J Exp Med 187 : 601 –608,1998
Gu L, Okada Y, Clinton SK, Gerard C, Sukhova GK, Libby P, Rollins BJ: Отсутствие моноцитарного хемоаттрактантного протеина-1 снижает атеросклероз у мышей с дефицитом рецепторов липопротеинов низкой плотности.Mol Cell2 : 275 –281,1998
Huang DR, Wang J, Kivisakk P, Rollins BJ, Ransohoff RM: Отсутствие моноцитарного хемоаттрактантного белка 1 у мышей приводит к снижению местного рекрутирования макрофагов и антигенспецифическому иммунному ответу Т-хелперных клеток 1 типа при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите. J Exp Med193 : 713 –726,2001
↵
Tesch GH, Schwarting A, Kinoshita K, Lan HY, Rollins BJ, Kelley VR: Моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 способствует опосредованному макрофагами повреждению канальцев, но не повреждению клубочков, в нефритоксической сыворотке. .Дж Клин Инвест103 : 73 –80,1999
↵
Christiansen T, Richelsen B, Bruun JM: Моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 вырабатывается в изолированных адипоцитах, что связано с ожирением и снижается после потери веса у субъектов с патологическим ожирением. Инт Дж. Обес (Лондон) 29 : 146 –150,2005
Takahashi K, Mizuarai S, Araki H, Mashiko S, Ishihara A, Kanatani A, Itadani H, Kotani H: ожирение повышает уровни MCP-1 в плазме, что приводит к увеличению количества CD11b-положительных моноцитов в мышей.J Biol Chem278 : 46654 –46660,2003
↵
Сартипи П., Лоскутов Д.Д.: Хемоаттрактантный белок 1 моноцитов при ожирении и инсулинорезистентности. Proc Natl Acad Sci U S A100 : 7265 –7270,2003
↵
Kanda H, Tateya S, Tamori Y, Kotani K, Hiasa K, Kitazawa R, Kitazawa S, Miyachi H, Maeda S, Egashira K, Kasuga M: MCP-1 способствует развитию макрофагов инфильтрация в жировую ткань, инсулинорезистентность и стеатоз печени при ожирении. J Clin Invest116 : 1494 –1505,2006
↵
Weisberg SP, Hunter D, Huber R, Lemieux J, Slaymaker S, Vaddi K, Charo I, Leibel RL, Ferrante AW Jr: CCR2 модулирует воспалительные и метаболические эффекты кормления с высоким содержанием жиров .J Clin Invest116 : 115 –124,2006
↵
Kamei N, Tobe K, Suzuki R, Ohsugi M, Watanabe T., Kubota N, Ohtsuka-Kowatari N, Kumagai K, Sakamoto K, Kobayashi M, Yamauchi T, Ueki Y, Nishimura S, Manabe I, Hashimoto H, Ohnishi Y, Ogata H, Tokuyama K, Tsunoda M, Ide T, Murakami K, Nagai R, Kadowaki T. Сверхэкспрессия моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 в жировой ткани вызывает рекрутирование макрофагов и инсулина сопротивление. J Biol Chem281 : 26602 –26614,2006
↵
McKnight AJ, Macfarlane AJ, Dri P, Turley L, Willis AC, Gordon S: Молекулярное клонирование F4 / 80, гликопротеина клеточной поверхности, ограниченного макрофагами мыши, гомологичного G- семейство рецепторов трансмембранных 7 гормонов, связанных с белками.J Biol Chem271 : 486 –489,1996
Cousin B, Munoz O, Andre M, Fontanilles AM, Dani C, Cousin JL, Laharrague P, Casteilla L, Penicaud L: роль преадипоцитов как макрофагоподобных клеток. FASEB J13 : 305 –312,1999
↵
Chen A, Mumick S, Zhang C, Lamb J, Dai H, Weingarth D, Mudgett J, Chen H, Macneil DJ, Reitman ML, Qian S: Диетическая индукция моноцитарного хемоаттрактантного белка -1 и его влияние на ожирение. Obes Res13 : 1311 –1320,2005
↵
Low QE, Drugea IA, Duffner LA, Quinn DG, Cook DN, Rollins BJ, Kovacs EJ, DiPietro LA: заживление ран в MIP-1alpha (- / -) и MCP-1 (-/-) мышей.Am J Pathol159 : 457 –463,2001
↵
Panoskaltsis-Mortari A, Hermanson JR, Taras E, Wangensteen OD, Charo IF, Rollins BJ, Blazar BR: повреждение легких после BMT происходит независимо от экспрессии CCL2 или его рецептора, CCR2 на клетках-хозяевах. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol286 : L284 –L292,2004
↵
Combadiere C, Ahuja SK, Van Damme J, Tiffany HL, Gao JL, Murphy PM: Моноцитарный хемоаттрактантный белок-3 является функциональным лигандом для CC-хемокиновых рецепторов 1 и 2B.J Biol Chem270 : 29671 –29675,1995
↵
Gong X, Gong W, Kuhns DB, Ben Baruch A, Howard OM, Wang JM: Хемотаксический белок моноцитов-2 (MCP-2) использует CCR1 и CCR2B в качестве своих функциональных рецепторов. J Biol Chem272 : 11682 –11685,1997
↵
Sarafi MN, Garcia-Zepeda EA, MacLean JA, Charo IF, Lustre AD: Хемоаттрактантный белок моноцитов мыши (MCP) -5: новый хемокин CC, который является структурным и функциональным гомологом человеческий MCP-1. J Exp Med185 : 99 –109,1997
↵
Garcia-Zepeda EA, Combadiere C, Rothenberg ME, Sarafi MN, Lavigne F, Hamid Q, Murphy PM, Lustre AD: Хемоаттрактантный белок моноцитов человека (MCP) -4 является новым CC хемокин с активностью в отношении моноцитов, эозинофилов и базофилов, индуцированной при аллергическом и неаллергическом воспалении, который передает сигнал через хемокиновые рецепторы CC (CCR) -2 и -3.Дж Иммунол157 : 5613 –5626,1996
↵
Герхардт С.К., Ромеро И.А., Канселло Р., Камоин Л., Стросберг А.Д.: Хемокины контролируют накопление жира и секрецию лептина культивируемыми адипоцитами человека. Молекулярный эндокринол175 : 81 –92,2001
↵
Matsukawa A, Hogaboam CM, Lukacs NW, Lincoln PM, Strieter RM, Kunkel SL: Эндогенный MCP-1 влияет на системный баланс цитокинов в модели острого септического перитонита на мышах. Опыт Мол Патол68 : 77 –84,2000
↵
Zisman DA, Kunkel SL, Strieter RM, Tsai WC, Bucknell K, Wilkowski J, Standiford TJ: MCP-1 защищает мышей от летальной эндотоксемии.J Clin Invest99 : 2832 –2836,1997

Обзор, клиническая презентация, лабораторные исследования

Автор

Брайан А. Миттон, доктор медицины, доктор философии Клинический инструктор, отделение детской гематологии-онкологии, педиатрический факультет Медицинской школы Стэнфордского университета

Раскрытие информации: раскрывать нечего.

Соавтор (ы)

Табита М. Куни, доктор медицины Сотрудник детской гематологии / онкологии, Детская больница Люсиль Паккард, Медицинская школа Стэнфордского университета

Табита М. Куни, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Американская академия педиатрии, Американское общество гематологии, Американское общество детской гематологии / онкологии, Группа детской онкологии, Американское общество клинической онкологии

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Специальная редакционная коллегия

Франсиско Талавера, фармацевт, доктор философии Адъюнкт-профессор, Фармацевтический колледж Медицинского центра Университета Небраски; Главный редактор Medscape Drug Reference

Раскрытие информации: Получил зарплату от Medscape за работу. для: Medscape.

Рональд Захер, MBBCh, FRCPC, DTM & H Профессор внутренней медицины и патологии, директор Центра крови Хоксворта, Академический центр здоровья Университета Цинциннати

Рональд Захер, MBBCh, FRCPC, DTM & H является членом следующих медицинских обществ : Американская ассоциация развития науки, Американская ассоциация банков крови, Американская клиническая и климатологическая ассоциация, Американское общество клинической патологии, Американское общество гематологии, Колледж американских патологов, Международное общество переливания крови, Международное общество по тромбозу и гемостазу, Королевский колледж врачей и хирургов Канады

Раскрытие информации: нечего раскрывать.

Главный редактор

Эммануэль Беса, доктор медицины Почетный профессор кафедры медицины, отделение гематологических злокачественных новообразований и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, Онкологический центр Киммела, Медицинский колледж Джефферсона Университета Томаса Джефферсона

Эммануэль Беса, доктор медицины, является членом следующих медицинских общества: Американская ассоциация по образованию в области рака, Американское общество клинической онкологии, Американский колледж клинической фармакологии, Американская федерация медицинских исследований, Американское общество гематологии, Нью-Йоркская академия наук

Раскрытие: Ничего не раскрывать.

Благодарности

Suzanne M Carter, MS Старший советник по генетике, младший специалист, Отделение акушерства и гинекологии, Отдел репродуктивной генетики, Медицинский центр Монтефиоре, Медицинский колледж Альберта Эйнштейна

Suzanne M Carter, MS является членом следующих медицинских обществ: Американская ассоциация адвокатов

Раскрытие: Ничего не нужно раскрывать. Сьюзан Дж. Гросс, доктор медицины, FRCS (C), FACOG, FACMG Содиректор, Отдел репродуктивной генетики, доцент кафедры акушерства и гинекологии Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна

Susan J Gross, MD, FRCS (C), FACOG, FACMG является членом следующих медицинских обществ: Американского колледжа медицинской генетики, Американского колледжа акушеров и гинекологов, Американского института ультразвука в медицине, Американской медицинской ассоциации, Американского общества генетики человека и Королевский колледж врачей и хирургов Канады

Раскрытие: Ничего не нужно раскрывать.

Рональд Захер, MB, BCh, MD, FRCPC Профессор, внутренняя медицина и патология, директор, Центр крови Хоксворта, Академический центр здоровья Университета Цинциннати

Рональд Захер, MB, BCh, MD, FRCPC является членом следующих медицинских обществ: Американской ассоциации развития науки, Американской ассоциации банков крови, Американской клинической и климатологической ассоциации, Американского общества клинической патологии, Американского общества Гематология, Колледж американских патологов, Международное общество переливания крови, Международное общество по тромбозу и гемостазу и Королевский колледж врачей и хирургов Канады

Раскрытие информации: Глаксо Смит Клайн Гонорария Выступление и преподавание; Членство в совете директоров Talecris Honoraria

Раскрытие информации: Medscape Salary Employment

Связь с модулированием ацетилирования между N-концевым доменом h4 и внутренне неупорядоченным C-концевым доменом h2 | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Линкерные гистоны (h2s) являются ключевыми структурными компонентами хроматина высших эукариот.Однако механизмы, с помощью которых внутренне неупорядоченный линкерный карбоксиконцевой домен гистона (h2 CTD) влияет на структуру хроматина и регуляцию генов, остаются неясными. Ранее мы продемонстрировали, что CTD h2.0 претерпевает значительную конденсацию (уменьшение расстояния от конца до конца) при связывании с нуклеосомами, что соответствует переходу к упорядоченной структуре или ансамблю структур. Здесь мы показываем, что делеция N-концевого хвоста h4 или установка имитаторов ацетилирования или bona fide ацетилирование в N-концевом хвосте h4 изменяет конденсацию связанных с нуклеосомами h2 CTD.Кроме того, мы представляем доказательства того, что N-хвост h4 влияет на конденсацию h2 CTD посредством прямого белок-белкового взаимодействия, а не изменения траектории линкерной ДНК. Эти результаты подтверждают возникающую гипотезу, согласно которой CTD h2 служит связующим звеном для передачи сигналов в нуклеосоме.

ВВЕДЕНИЕ

Геном эукариот упакован в нуклеосомы, которые состоят из ядра нуклеосомы, линкерной ДНК и линкерного гистона (h2). Ядро нуклеосомы состоит из 147 п.н. сегментов ДНК, намотанных вокруг октамера гистонов ядра, который состоит из двух копий каждого из гистонов ядра h3A, h3B, h4 и h5 (1).Соседние NCP связаны линкерной ДНК переменной длины (10–90 п.н.) с образованием массивов олигонуклеосом (2). h2s связываются с поверхностью нуклеосом рядом с диадой и сближают две линкерные ДНК, образуя стеблеобразную структуру (2,3,4). Индуцированное h2 закрытие линкерной ДНК дополнительно подтверждается недавней криогенной электронной микроскопией (крио-ЭМ) и кристаллическими структурами нуклеосомы длиной 197 п.н., содержащей полноразмерный h2, в котором глобулярный домен h2 связывается с ДНК на диада нуклеосомы и взаимодействует с обоими линкерными сегментами ДНК (4).Уменьшение угла входа-выхода нуклеосомной линкерной ДНК в результате стеблеобразной структуры может вносить вклад в уникальный зигзагообразный паттерн складывания нуклеосом в массивах олигонуклеосом, который дополнительно облегчает уплотнение хроматина (5). Интересно, что структурные переходы в h2 могут вносить вклад в различные плотности упаковки нуклеосом и конформации олигонуклеосом (4,6,7)

Хроматин — очень динамичный объект, и доступность геномной ДНК может регулироваться различными механизмами, включая посттрансляционные модификации (ПТМ) на домены гистонового хвоста, АТФ-зависимое ремоделирование хроматина и замена канонических гистонов специализированными вариантами (8-12).Ацетилирование гистонов обычно связано с активной транскрипцией и может напрямую нарушать взаимодействия нуклеосома-нуклеосома или контакты гистон-ДНК, а также косвенно функционировать в качестве платформы, которая распознается различными белками (13–16). Напротив, h2s стабилизируют сворачивание расширенных массивов нуклеосом в структуры хроматина более высокого порядка и истощаются в сайтах начала транскрипции активных генов (5,17-22). Однако, как ацетилирование гистонов регулирует структуру хроматина в сочетании с эффектами линкерного гистона, все еще остается открытым вопросом.

У высших эукариот h2 имеют трехчастную структуру, состоящую из короткого N-концевого домена (NTD), консервативного трипсин-устойчивого центрального глобулярного домена, ответственного за структурно-специфическое связывание с нуклеосомой, и длинного, чрезвычайно основного ∼100 С-концевой домен аминокислоты (CTD), который необходим для связывания хроматина с высоким сродством in vivo и жизненно важен для конденсации хроматина (23-25). В то время как глобулярный домен является высококонсервативным среди соматических изоформ h2 (сходство 80–100% среди h2s человека), CTD менее консервативны (сходство 40–80%).Тем не менее, CTD h2 действительно демонстрируют высокое сходство в общем аминокислотном составе с ~ 40% соматических CTD h2, состоящих из основных аминокислот, почти всех лизинов с редким аргинином и с аланином, серином и пролином, составляющими большинство оставшихся остатков (2 , 26,27). CTD h2 почти полностью лишены кислотных и ароматических остатков. Эти особенности последовательности характерны для белков с внутренней неупорядоченностью (IDP) (27). Хотя CTD h2 не структурирован в водном растворе, пептиды, полученные из этого домена, проявляют вторичные структуры при связывании с ДНК или в растворителях, стабилизирующих вторичную структуру, таких как TFE (28,29).Недавняя работа с использованием резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) показывает, что h2 CTD конденсируется при взаимодействии с нуклеосомами, что согласуется с переходом от неупорядоченного к упорядоченному (25,30). Однако неясно, принимает ли конденсированный h2 CTD определенную структуру или ансамбль структур. Кроме того, CTD h2 в меньшей степени конденсируется при связывании с массивами олигонуклеосом по сравнению с таковым, индуцируемым при связывании с мононуклеосомами (6). Важно отметить, что структура h2 CTD, по-видимому, тесно связана с линкерной траекторией ДНК, которая изменяется из-за присутствия соседних нуклеосом в массивах.Сочетание структуры CTD и конформации линкерной ДНК в массиве нуклеосом повышает возможность дополнительного уровня регуляции структуры хроматина, при котором изменение склонности к изменениям в конденсации CTD может регулировать доступность в конденсированном хроматине (6).

Хвосты ядер гистонов выступают за пределы ядер нуклеосомной частицы либо через каналы, образованные выровненными сверхспиральными круговоротами ДНК (N-концевой хвост h3B и N-концевой хвост h4), либо над / под ними (N-концевой хвост h3A и N-концевой h5 -конечный хвост) (31).Хотя это и не важно для структуры мононуклеосом, хвосты коровых гистонов необходимы для формирования структуры хроматина более высокого порядка (32). Удаление N-концевого хвоста h5 снижает MgCl ₂-зависимое сворачивание и самоассоциацию реконструированных массивов нуклеосом (33). Ацетилирование h5K16 (остаток Lys в N-концевом хвосте h5) также нарушает способность олигонуклеосом подвергаться солевому уплотнению (34). N-концевой хвост h4 переключается с внутринуклеосомных взаимодействий в протяженных массивах олигонуклеосом на межнуклеосомные взаимодействия в конденсированном хроматине (35).

N-концевые хвостовые домены h4 выступают из нуклеосомы между сверхспиральными круговоротами ДНК, примерно на один виток спирали в каждую сторону от центра нуклеосомы, рядом с каноническим сайтом связывания h2 на поверхности нуклеосомы (31). Следовательно, хвостовые домены h4 расположены рядом с тем местом, где линкерная ДНК входит и выходит из нуклеосомы, и исследования сшивания показывают, что они взаимодействуют с линкерной ДНК в мононуклеосомах (36–38). Таким образом, как h2, так и N-концевой хвост h4 взаимодействуют с линкерной ДНК.CTD h2 также модулирует динамику N-концевого хвоста h4 в нуклеосомах и препятствует посттрансляционным модификациям (PTM), таким как ацетилирование, метилирование и фосфорилирование в N-концевом хвосте h4 in vitro (39). Учитывая тесную близость хвостового домена h4 и CTD h2, мы пришли к выводу, что хвостовой домен h4 может взаимодействовать или иным образом вносить вклад в среду связывания h2 и, следовательно, может влиять на конденсацию CTD h2 (25,30). Поэтому мы исследовали, влияет ли хвостовой домен h4 на структуру, связанную с нуклеосомами h2 CTD.Мы обнаружили, что делеция N-концевого хвоста h4 или установка миметиков ацетилирования в N-концевом хвосте h4 изменяет конденсацию h2 CTD по сравнению с немодифицированными мононуклеосомами. Более того, имитаторы ацетилирования и истинное ацетилирование лизина хвостового домена h4 имеют идентичные эффекты на конденсацию h2 CTD. Интересно, что анализ модификаций хвоста h4 на траектории линкерной ДНК и исследования сшивания хвоста h4 показывают, что хвост h4 сообщается непосредственно с CTD h2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспрессия и очистка линкерных гистонов и коровых гистонов

Линкерный гистон h2 (0) из Xenopus laevis (здесь обозначается как h2) и двойной цистеиновый мутант (h2G101CK195C) были экспрессированы в бактериальных клетках BL21 (DE3) с использованием плазмиды pET3ah2 (0) a (25). Вкратце, кодирующую последовательность h2 вставляли в вектор pET3a (Novagen), и линкерные гистоны очищали ионообменной хроматографией с использованием смолы Biorex-70 (Bio-Rad), как описано (25).Концентрацию h2 определяли путем количественного сравнения со стандартом h2, концентрация которого определялась аминокислотным анализом (25).

Все гистоны h4 (включая мутанты хвоста h4), использованные в этом исследовании, содержали замену цистеина на аланин в положении 110. Гистон h4 и h5 экспрессировались в бактериальных клетках BL21 (DE3). Экспрессию и очистку h4 и h5 проводили, как описано ранее (40), за исключением мутанта с делецией N-хвоста h5, который культивировали при 30 ° C.Концентрацию очищенного тетрамера h4 / h5 определяли путем количественного сравнения со стандартным тетрамером h4 / h5.

Гистоны h3A и h3B, включая мутанты с делецией хвоста, экспрессировались в бактериальных клетках BL21 (DE3). Экспрессию и очистку димера h3A / h3B проводили, как описано ранее (41). Концентрацию димера h3A / h3B определяли путем количественного сравнения со стандартным тетрамером.

Нативное химическое лигирование ацетилированного пептида с гистоном h4

Истинные ацетилированные белки гистона h4 были синтезированы с помощью нативного химического лигирования в одном сосуде и десульфуризации с метилтиогликолатом (MTG) (42).Вкратце, химически синтезированный N-концевой пептид гистона h4 (1-28), содержащий специфические паттерны ацетилирования гистона, лигировали с глобулярной частью гистона h4 (A29C-135, C110A). Химически синтезированный N-концевой пептид h4 (470 нмоль, 1,90 мг в случае h4–3Ac2) и экспрессированный C-концевой пептид (162 нмоль, 2,45 мг) растворяли в 62,1 мкл буфера NCL (6 M GdnHCl, 0,2 M NaH. ₂ PO ₄ при pH 7,0). К реакционной смеси добавляли 16,2 мкл раствора MTG (500 мМ в буфере NCL) и 2 мкл раствора.7 мкл раствора TCEP (600 мМ в буфере NCL). PH доводили до 7,0 добавлением 1 н. Водн. NaOH. Всю смесь перемешивали при 37 ° C в течение 3 ч в атмосфере аргона. Затем 54,0 мкл раствора TCEP (500 мМ), 13,0 мкл раствора глутатиона (1 M) и 12,2 мкл VA-044 водн. добавляли, и реакционный раствор перемешивали при 37 ° C в течение 1 ч в атмосфере аргона. Наконец, весь реакционный раствор разбавляли 25% водным раствором ацетонитрила, затем очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с получением желаемых лигированных и десульфуризованных продуктов: 2.45 мг (выход 44%) для h4-WT, 1,35 мг (выход 37%) для h4–6Ac, 0,74 мг (выход 44%) для h4–3Ac1 и 1,39 мг (выход 45%) для h4–3Ac2. Поскольку цистеин в положении 29 был преобразован в аланин путем десульфуризации после лигирования, мутации в последовательность не вводили, за исключением C110A. Полноразмерный h4, несущий специфические паттерны ацетилирования гистонов, был идентифицирован с помощью MALDI-TOF MS.

601 фрагменты ДНК для восстановления нуклеосом

фрагментов ДНК для восстановления нуклеосом были получены путем переваривания плазмиды p207-12 с помощью EcoRV и выделения фрагментов ДНК размером 207 п.н., содержащих последовательность позиционирования 601 (43), на 0.8% агарозные гели путем электроэлюирования. Меченую ДНК размером 207 п.н. получали с помощью ПЦР с использованием меченых праймеров (GenScript). Cy3 и Cy5 конъюгировали с аминомодификатором C6-dT для внутреннего мечения. Прямой праймер: ATCGGACCC / iCy5N / ATACGCGGCC, обратный праймер: AGTAG / iCy3N / ATTAATTAATGAATTCGGATCCACATGCAC. Положение Cy3 и Cy5 в праймере обозначено iCy3N и iCy5N соответственно. После ПЦР флуоресцентно меченные фрагменты ДНК размером 207 п.н. очищали с помощью набора для очистки ПЦР (Qiagen).

Восстановление нуклеосом

Нуклеосомы восстанавливали с помощью стандартного ступенчатого солевого диализа.Вкратце, 10 мкг тетрамера h4 / h5, 11,6 мкг димера h3A / h3B и 20 мкг 601 ДНК добавляли в буфер для восстановления (10 мМ Трис, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ DTT и 2 М NaCl) в общем объеме. 600 мкл, переносят в диализную трубку, затем диализуют против ТЕ, содержащего уменьшающиеся концентрации NaCl при 1,2, 1, 0,8, 0,6 М, каждый по 2 часа при 4 ° C, с последующим диализом против ТЕ в течение ночи при 4 ° C.

Восстановленные нуклеосомы очищали с использованием 10 мл градиента сахарозы 7–20% путем ультрацентрифугирования в роторе Beckmann SW41 в течение 18 часов при 34 000 g и температуре 4 ° C.Фракции, содержащие нуклеосомы, объединяли и концентрировали до конечной концентрации 0,1-0,3 мкМ, используя фильтровальную установку для микроцентрифугирования (EMD Millipore) с пределом номинальной молекулярной массы мембраны 50 кДа. Очищенные нуклеосомы анализировали в 0,7% агарозном геле и 18% SDS-PAGE.

Присоединение малеимида-Cy3 и малеимида-Cy5 к линкерному гистону

h2 G101C K195C, в котором цистеины были расположены на обоих концах CTD h2 (25), инкубировали в 50 мМ DTT в течение одного часа для полного восстановления остатков цистеина, затем DTT удаляли хроматографией Bio-Rex 70 и восстановленный белок раствор немедленно замораживали на сухом льду.Фракции, содержащие восстановленный h2 G101C K195C, обрабатывали 5-10-кратным избытком либо малеимида-Cy3, либо малеимида-Cy5, или смеси обоих 50/50 в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте в соответствии с инструкциями производителя (GE Healthcare ). Свободные красители удаляли с помощью еще одного раунда хроматографии Bio-Rex. Концентрацию меченного флуорофором h2 определяли путем количественного сравнения со стандартом h2, как описано выше.

Анализ FRET

_(A)

E — эффективность FRET, ϵ ^D (λ ′) и ϵ ^A (λ ′) — коэффициенты экстинкции донора (Cy3) и акцептор (Cy5) соответственно. d ⁺ — доля меченных донорами молекул, λ ‘- длина волны для возбуждения Cy3 515 нм, λ ″ — длина волны для возбуждения Cy5 при 610 нм. В числителе представлена интенсивность FRET, а в знаменателе — сигнал флуоресценции от непосредственно возбужденного акцептора (уравнение 1). {\ prime \ prime}}}} \ right) }} \ end {уравнение *} $$

ΔE не зависит от d ⁺, и для вычисления Δ E требуется только один точный E _h2alone.Здесь мы определили d ⁺ = 0,66 только для меченого h2, как описано ранее (44). Все определения основаны на N ≥ 3 повторах.

Эксперимент FRET на расстоянии от конца до конца линкерной ДНК проводили аналогично вышеупомянутому эксперименту h2 CTD FRET. Обратите внимание, что флуоресцентно меченая нуклеосома имеет Cy3 и Cy5, специфически включенные на определенных концах ДНК, поэтому d ⁺ = 1. Для этой работы ^D (515) = 53160 см ^-1 M ^-1 (Cy3) , ^A (515) = 3749 см ⁻¹ M ⁻¹ (Cy5), ϵ ^A (610) = 118 400 см ⁻¹ M ⁻¹ (Cy5).

Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA)

Нуклеосомы 601 п.н. (70 нг, ∼15 нМ) и h2 в количествах, указанных в подписи к рисунку, инкубировали при 25 ° C в течение 30 мин в 20 мкл связывающего буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 150 нг / мкл БСА и 5% (об. / Об.) Глицерина). Затем реакционные смеси загружали непосредственно в нативный 5% -ный полиакриламидный гель (акриламид: бисакриламид = 19: 1) и прогоняли при 160 В в течение 3 часов при 4 ° C. Полосы ДНК и нуклеосом были обнаружены либо окрашиванием бромистым этидием, либо с помощью тепловизора Typhoon с использованием настройки возбуждения и излучения Cy5.

сшивание h4

Для сшивания h2 – h4 модифицированные 4-азидофенацилбромидом (APB) нуклеосомы h4T6C или нуклеосомы WT инкубировали с меченным Cy5 h2 G101C в связывающем буфере (10 мМ Tris – HCl, pH 8,0, 1 мМ EDTA, 50 мМ NaCl и 5% об. / об. глицерина) в течение 30 мин при 25 ° C. Реакции помещали в пробирку из пирекса и облучали при 365 нм в течение 90 с, как описано ранее (4,37). Продукты сшивания h2 / h4 анализировали путем разделения компонентов на 15% SDS-PAGE геле и визуализации компонентов, меченных Cy5, на устройстве для визуализации Typhoon с использованием фильтров возбуждения и испускания Cy5.Картирование сшивки хвоста h4 на ДНК проводили, как описано (37). Вкратце, нуклеосомы восстанавливали с помощью APB-модифицированных h4 T6C и 207 601 фрагментов ДНК, меченных радиоактивной меткой на 5′-конце одной из двух цепей. Нуклеосомы инкубировали 10 мин. в 10 мМ Трис, pH 8,0, 1 мМ EDTA, 50 мМ NaCl, в отсутствие или в присутствии h2 и сшивание инициировали, как описано выше. ДНК выделяли из облученных образцов, разрывы цепей образовывались в сайтах сшивания и сайты сшивок, картированные путем прогона продуктов на 6% полиакриламидных денатурирующих гелях (секвенирование), как описано (37).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Делеция N-концевого хвостового домена h4 изменяет конденсацию CTD h2

Учитывая близость доменов хвоста h4 и сайта связывания h2 в нуклеосоме, а также влияние CTD h2 на ферментативную модификацию хвоста h4 (36,39), мы предположили, что N-концевой хвост h4 может влиять на окружающую среду и таким образом, структура связанного с нуклеосомами h2 CTD. Чтобы проверить эту гипотезу, мы воссоздали нуклеосомы с рекомбинантными коровыми гистонами, содержащими либо полноразмерный h4 (WT), либо h4, лишенный N-концевого хвостового домена (gh4), и использовали подход FRET для мониторинга степени конденсации CTD h2 при связывании. к нуклеосомам WT или gh4 (Рисунок 1A и B, дополнительный рисунок S1).Мы измерили разницу в эффективности FRET (Δ E ) между нуклеосомным связанным и свободным меченным h2 в диапазоне концентраций нуклеосома: h2, чтобы гарантировать насыщенное (1: 1) связывание нуклеосом с помощью h2. В соответствии с предыдущей работой, флуоресцентная эмиссия акцептора Cy5 (пик ∼ 670 нм) демонстрировала увеличение при связывании меченого h2 с нуклеосомами WT и, как следствие, увеличение FRET (Δ E ), что указывает на снижение сквозного расстояние через h2 CTD после связывания с нуклеосомами (рис. 1C и D).Мы называем зависимое от нуклеосомы изменение CTD h2 «конденсацией». Важно отметить, что делеция N-концевого хвостового домена h4 привела к значительному снижению ответа FRET по сравнению с нуклеосомами WT (рис. 1C). Количественная оценка показала, что связывание h2 с нуклеосомами WT демонстрирует Δ E , равное ∼0,4, которое снижается до ∼0,18 для связывания h2 с нуклеосомами gh4 (рис. 1D). Обратите внимание, что в обоих случаях Δ E достигает постоянных значений в отношениях нуклеосома: h2 приблизительно ≥1, что указывает на насыщение связывания h2 с нуклеосомами.Важно отметить, что на нуклеосомно-зависимые CTD h2 не влияла делеция либо хвостовых доменов h3B, либо h5 (дополнительные рисунки S2A и B). Эти результаты показывают, что N-концевой хвостовой домен h4 — но не домены h3B или h5 — необходим для полной конденсации CTD h2 в нуклеосомах.

Рисунок 1.

Хвостовой домен h4 влияет на структуру CTD h2 в нуклеосоме. Нуклеосомы восстанавливали либо с полноразмерным h4 (WT), либо с h4, лишенным N-концевого хвостового домена (gh4), и анализы FRET проводили с h2, меченным Cy3 / Cy5 на любом конце h2 CTD.( A ) h2 G1010C K195C был мечен флуорофорами Cy3 и Cy5. ( B ) Схема, показывающая WT h4 и делецию N-концевых 28 остатков в gh4. ( C ) Спектры излучения только h2 (синий) и h2, связанного с нуклеосомами WT (черный) или нуклеосомами gh4 (пурпурный). Возбуждение Cy3 было при 515 нм; пики эмиссии Cy3 и Cy5 (∼560 и ∼670 нм) обозначены синими стрелками. ( D ) График разницы эффективности FRET (Δ E ) для образцов с указанными отношениями нуклеосома: h2.Δ E рассчитывали как разницу в эффективности FRET для комплексов h2-нуклеосома и свободного h2 для независимых испытаний. Приведенные планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения (SD). Значения P представляют собой вероятности, связанные с двусторонним тестом Стьюдента t . N ≥ 3. (***), P <0,001.

Рисунок 1.

Чтобы исследовать, влияет ли N-концевой хвостовой домен h4 на конденсацию h2 CTD в комплексах хроматина за пределами мононуклеосом, мы расширили наш анализ степени конденсации h2 CTD на асимметричные динуклеосомы.Эти динуклеосомы содержат расстояние между нуклеосомами 207 п.н. (30- N -60- N -0, где N = 147 п.н. ‘ядерной’ ДНК) с линкерной ДНК 30 п.н. на одной стороне динуклеосомы (дополнительная Рисунок S4A и B). Мы выбрали асимметричные динуклеосомы, поскольку мы показали, что степень конденсации CTD h2 идентична степени конденсации более длинных массивов нуклеосом (6). Более того, h2 связывается преимущественно с нуклеосомой внутри асимметричной динуклеосомы, которая имеет два линкерных сегмента ДНК (дополнительный рисунок S4A и B), что позволяет избежать осложнений из-за межмолекулярной (h2-h2) FRET (6).В соответствии с предыдущими выводами, CTD h2 подвергается конденсации при связывании с динуклеосомой, но в конечном итоге несколько менее компактен по сравнению с h2, связанным с мононуклеосомами (дополнительный рисунок S4C) (6). Важно отметить, что связывание h2 с динуклеосомами, содержащими gh4, приводит к значительному снижению конденсации CTD h2 по сравнению с динуклеосомами, содержащими WT h4, что согласуется с результатами, наблюдаемыми в мононуклеосомах (дополнительный рисунок S4C).

Чтобы определить, требуется ли отдельная подобласть хвоста h4 для конденсации CTD h2, мы приготовили два дополнительных мутанта h4 с частичными делециями хвоста (рис. 2А).Мы обнаружили, что делеция первых десяти остатков хвоста h4 (Δ10) уменьшала конденсацию CTD h2, как обнаружено с помощью нашего анализа FRET, в то время как удаление дополнительных десяти остатков (Δ20) не приводило к дополнительному изменению в общей структуре CTD h2 (рис. 2Б). Однако делеция остатков 21–28 для генерации gh4 приводит к дальнейшему снижению конденсации CTD h2. Эти результаты подтверждают, что две отдельные области в пределах хвоста h4 вносят вклад в определение структуры связанного с нуклеосомами h2.

Рисунок 2.

Две области в хвосте h4 влияют на конденсацию CTD h2 в нуклеосомах. ( A ) Схема WT h4 и h4 ΔN10, ΔN20 и gh4 с делециями на N-конце хвоста из 10, 20 и 28 остатков, соответственно. ( B ) FRET-ответ (ΔE) для WT h4 (черный), h4 ΔN10 (красный), h4 ΔN20 (зеленый) и gh4 (пурпурный), оцененный в соотношениях нуклеосома: h2, указанных под графиком. Цифры в (A) указывают первый остаток в каждом белке. Полосы над схемой для WT h4 указывают области, которые влияют на структуру CTD h2.(***) P <0,001, (*) P <0,05.

Рисунок 2.

Две области в хвосте h4 влияют на конденсацию CTD h2 в нуклеосомах. ( A ) Схема WT h4 и h4 ΔN10, ΔN20 и gh4 с делециями на N-конце хвоста из 10, 20 и 28 остатков, соответственно. ( B ) FRET-ответ (ΔE) для WT h4 (черный), h4 ΔN10 (красный), h4 ΔN20 (зеленый) и gh4 (пурпурный), оцененный в соотношениях нуклеосома: h2, указанных под графиком. Цифры в (A) указывают первый остаток в каждом белке.Полосы над схемой для WT h4 указывают области, которые влияют на структуру CTD h2. (***) P <0,001, (*) P <0,05.

Имитаторы ацетилирования N-хвоста h4 уменьшают конденсацию CTD h2

Далее мы решили определить, влияют ли другие модификации N-терминального концевого домена h4 на структуру CTD h2. Шесть остатков лизина в хвосте h4 (K4, K9, K14, K18, K23 и K27) были идентифицированы как сайты ацетилирования in vivo .Мы заменили эти шесть лизинов на глутамин, чтобы имитировать ацетилированный лизин (h4 6KQ), и приготовили нуклеосомы (рис. 3А). Титрование нуклеосом h4 6KQ с меченым h2 привело к Δ E ∼0,28, что значительно меньше, чем наблюдаемое для связывания h2 с нуклеосомой WT (рис. 3B). Таким образом, подобно делециям хвоста h4, имитаторы ацетилирования влияют на степень конденсации связанных с нуклеосомами h2 CTD. Чтобы дополнительно определить, какие замены K → Q в хвосте h4 ответственны за снижение конденсации CTD h2, мы сконструировали мутанты h4 3KQ1 и h4 KQ2, в которых лизины K4, K9 и K14 или лизины K18, K23 и K27 в пределах h4 N-концевой хвостовой домен был заменен глутаминами соответственно (рис. 3А).Мы наблюдали, что, хотя ΔE не претерпевает значительных изменений при включении h4 3KQ1 в нуклеосомы, ΔE и, следовательно, степень конденсации h2 CTD значительно снижается при взаимодействии с нуклеосомами h4 3KQ2 по сравнению с нуклеосомами WT (рис. 3C и D). Таким образом, ацетилирование лизина имитаторы, установленные на K18, K23 и K27 в более внутренней области N-концевого хвоста h4, но не те, которые находятся рядом с N-концом, влияют на конденсацию CTD h2. Важно отметить, что ни один имитатор ацетилирования, установленный в любом из трех внутренних положений, не привел к изменению эффективности FRET, равно как и замена h4 серина 10 на глутаминовую кислоту для имитации фосфорилирования S10 (дополнительные рисунки S2C и D).Мы также расширили анализ, чтобы исследовать имитаторы ацетилирования в N-концевом хвосте h5. В соответствии с отсутствием эффекта удаления хвоста h5, имитаторы ацетилирования в пределах N-хвоста h5 по K5, K8, K12 и K16 не влияли на конденсацию CTD h2 (данные не показаны). В целом, эти результаты показывают, что имитаторы ацетилирования лизина присутствуют в определенных местах в пределах хвостового домена h4, но не фосфорилирование h4 S10 или модификации других N-концевых хвостовых доменов, изменяют структуру связанного с нуклеосомами h2.

Рисунок 3.

Имитаторы ацетилирования лизина в хвостовом домене h4 влияют на конденсацию CTD h2. Белки h4, содержащие замены K → Q в известных сайтах ацетилирования лизина, были включены в нуклеосомы, и степень конденсации CTD h2 была определена с помощью анализа FRET. ( A ) Схема, показывающая сайты замены K → Q в хвостовом домене h4. ( B– D ) FRET-анализ меченого h2, связанного с нуклеосомами h4 6KQ, h4 3KQ1 и h4 3KQ2, по сравнению с WT в соотношениях нуклеосома: h2, указанных в легенде к рисунку.NS, существенной разницы нет; (***) P <0,001, (*) P <0,05.

Рисунок 3.

Модификация N-концевого хвоста h4 не влияет на конденсацию h2 CTD за счет изменения траектории линкерной ДНК

Предыдущая работа показала, что степень конденсации h2 CTD зависит от траектории линкерной ДНК (6). Чтобы определить, изменяют ли исследованные выше модификации N-концевого хвоста h4 конденсацию CTD h2 посредством изменений линкерного пути ДНК, мы воссоздали нуклеосомы, в которых концы ДНК были помечены донорными и акцепторными флуорофорами FRET.Затем мы отслеживали FRET, чтобы определить, изменяют ли модификации h4 траекторию линкерной ДНК в разных нуклеосомных контекстах. Мы наблюдали существенную потерю FRET между концами линкерной ДНК в нуклеосомах gh4 по сравнению с WT, что указывало на открытие линкерной ДНК нуклеосомы при удалении N-концевого хвоста h4, что согласуется с предыдущими наблюдениями (45). Расчетное среднее расстояние от конца до конца линкерной ДНК для нуклеосомы WT составляет ∼6,04 нм, которое увеличилось до ∼6,63 нм для нуклеосомы gh4 (рис. 4A и B).Изменение геометрии линкерной ДНК дополнительно подтверждается анализом сдвига электрофоретической подвижности (EMSA), поскольку нуклеосомы gh4 проходят через гель медленнее, чем нуклеосомы WT, что соответствует более открытой конформации нуклеосом (дополнительный рисунок S3). В соответствии с крио-ЭМ структурным анализом (4,5) связывание h2 привело к гораздо более компактной структуре нуклеосомы с уменьшенным расстоянием между линкерами ДНК. Рассчитанное расстояние от конца до конца линкерной ДНК уменьшилось до ~ 4,56 нм в присутствии h2.Точно так же анализы EMSA показывают, что связанные с h2 нуклеосомы мигрируют быстрее через нативный PAGE, чем несвязанные нуклеосомы WT, что свидетельствует о более компактной структуре (дополнительный рисунок S3). Неожиданно мы обнаружили, что, несмотря на различие в разделении линкерной ДНК в нуклеосомах WT и gh4, расстояние от конца до конца линкерной ДНК было идентичным в h2-связанных нуклеосомах gh4 и WT (рис. 4A и B). Эти результаты предполагают, что различие в линкерной структуре ДНК не объясняет влияние делеции хвоста h4 на структуру CTD h2.

Рисунок 4.

сходно в h2-связанных нуклеосомах WT и gh4. ( A ) Эффективность FRET определяли для нуклеосом WT и gh4, содержащих метки Cy3 и Cy5, прикрепленные к концам ДНК (см. Материалы и методы) в отсутствие или в присутствии h2, как указано. (*), P <0,05; NS, существенной разницы нет. ( B ) Схема, описывающая изменения расстояния между концом линкерной ДНК, наблюдаемые в (A).

Рис. 4.

Линкерное расстояние между концом ДНК сходно в h2-связанных нуклеосомах WT и gh4. ( A ) Эффективность FRET определяли для нуклеосом WT и gh4, содержащих метки Cy3 и Cy5, прикрепленные к концам ДНК (см. Материалы и методы) в отсутствие или в присутствии h2, как указано. (*), P <0,05; NS, существенной разницы нет. ( B ) Схема, описывающая изменения расстояния между концом линкерной ДНК, наблюдаемые в (A).

Затем мы исследовали межконцевые расстояния линкерной ДНК в нуклеосомах, содержащих миметики ацетилирования.Подобно результатам для нуклеосом gh4, нуклеосомы h4 6KQ демонстрируют раскрытие линкерных концов ДНК по сравнению с нуклеосомами WT (рис. 5). Следует отметить, что включение h4 3KQ1 также привело к увеличению расстояния между концами линкерной ДНК, хотя и в меньшей степени по сравнению с h4 6KQ, в то время как между нуклеосомами h4 3KQ2 и WT не было обнаружено значительной разницы в расстоянии от конца до конца. Примечательно, что эти результаты прямо противоположны эффектам этих мутаций на структуру CTD h2, где мы обнаружили, что h4 3KQ2, но не h4 3KQ1, снижает конденсацию CTD h2 (Рис. 3).Таким образом, приведенные выше данные противоречат гипотезе о том, что модификации N-концевого хвоста h4 влияют на конденсацию h2 CTD через измененную траекторию линкерной ДНК.

Рисунок 5.

в нуклеосомах, содержащих миметики ацетилирования, не коррелируют с эффектами на структуру h2 CTD. FRET использовался для оценки сравнения межконцевых расстояний линкерной ДНК в нуклеосомах WT, h4 6KQ, h4 3Q1 и h4 3KQ2, как показано на фиг. 4. NS, существенной разницы нет; (*) P <0.05; (**) P <0,01.

Рис. 5.

Межконцевые расстояния линкерной ДНК в нуклеосомах, содержащих миметики ацетилирования, не коррелируют с эффектами на структуру h2 CTD. FRET использовался для оценки сравнения межконцевых расстояний линкерной ДНК в нуклеосомах WT, h4 6KQ, h4 3Q1 и h4 3KQ2, как показано на фиг. 4. NS, существенной разницы нет; (*) P <0,05; (**) P <0,01.

Глютамин эффективно моделирует ацетилированный лизин

Поскольку химическая структура глутамина не идентична ацетилированному лизину, мы хотели определить, действительно ли замены лизина на глутамин точно отражают эффекты ацетилирования bona fide на структуру h2 CTD.Поэтому мы приготовили белки гистона h4 полной длины путем нативного химического лигирования, которые были гомогенно ацетилированы в пределах N-концевого хвоста. Были получены три различных ацетилированных белка: h4 6Kac, в котором лизины K4, K9, K14, K18, K23 и K27 были ацетилированы, и h4 3Kac1 и h4 3Kac2, где лизины K4, K9 и K14, и K18, K23 и K27 были ацетилированы. соответственно (рисунок 6A, см. также дополнительный рисунок S5). Эти белки были восстановлены с немодифицированными h3A, h3B и h5 для создания нуклеосом, содержащих однородно ацетилированный h4.В соответствии с предыдущими экспериментами, h4 6Kac приводил к значительному уменьшению конденсации CTD h2, на что указывает снижение FRET по сравнению с немодифицированным WT h4, аналогично тому, которое наблюдалось с h4 6KQ (сравните Фигуры 3B и 6B). Аналогичным образом, хотя степень конденсации CTD h2 существенно не различалась между нуклеосомами, содержащими h4 WT и h4 3Ac1, h4 3Ac2 вызывал уменьшение конденсации CTD h2 по сравнению с немодифицированными нуклеосомами WT, опять же параллельно с эффектами замен K → Q (Рисунок 6B). ).Наконец, нуклеосомы h4 6KAc показали уменьшение (по сравнению с нуклеосомами WT) расстояния между концами линкерной ДНК, идентичное таковому у нуклеосом h4 6KQ (Рисунок 6C). Эти анализы показывают, что ацетилирование K → Q имитирует и ацетилирование bona fide в пределах Хвостовой домен h4 имел практически идентичные эффекты на конденсацию CTD h2.

Рисунок 6.

Ацетилирование лизина в хвостовом домене h4 влияет на конденсацию CTD h2. Белки h4, содержащие ацетилированные лизины в известных сайтах ацетилирования лизина, были включены в нуклеосомы, и степень конденсации CTD h2 была определена с помощью анализа FRET.( A ) Схема, показывающая сайты ацетилирования лизина в хвостовом домене h4. ( B ) FRET-анализ меченого h2, инкубированного с WT и нуклеосомами h4 6Ac, h4 3Ac1 и h4 3Ac2 при указанных соотношениях нуклеосома: h2. NS, существенно не отличающийся от WT; (*) P <0,05. Обратите внимание, что расчетное значение P для h4 3Ac2 при соотношении 1,2 составляет 0,07 (не указано). Анализ совокупных данных для образцов, в которых связывание h2-нуклеомы является насыщенным (отношения 1,0, 1,1 и 1,2), показывает, что P -значения ≤ 3.0E – 07, 0,30 и 6.7E-05 для h4 6Ac, h4 3Ac1 и h4 3Ac2, соответственно, по сравнению с WT (дополнительный рисунок S6). ( C ) Bona fide ацетилирование лизина (6Ac) в хвосте h4 оказывает идентичное влияние на расстояние от конца до конца линкерной ДНК по сравнению с имитатором ацетилирования K → Q (6KQ). NS, существенно не отличающийся от WT; (**) P <0,01.

Рисунок 6.

Обнаружение взаимодействия между N-концевым хвостовым доменом h4 и h2 в нуклеосоме

Затем мы спросили, существует ли N-концевой хвостовой домен h4 достаточно близко к h2, чтобы обеспечить перекрестное связывание белка с белком внутри нуклеосомы.Мы использовали подход сайт-специфического сшивания, в котором остаток гистона модифицируют азидофенацилбромидом (APB), и сшивание инициируется кратковременным облучением УФ-светом. Сшивание происходит либо с белком, либо с ДНК в пределах 0–12Å от углерода Cα APB-модифицированного цистеина (37,47). Чтобы определить, находится ли хвост h4 в непосредственной близости от h2 в нуклеосоме, мы модифицировали мутант h4 h4 T6C с помощью APB и включили модифицированный белок в нуклеосомы (37). Мы связали Cy5-меченный h2 G101C с нуклеосомами и активировали сшивание с помощью кратковременного УФ-облучения.Комплексы h2-нуклеосомы затем загружали в гели SDS-PAGE и анализировали с помощью флюорографии, чтобы позволить обнаружение флуоресцентно меченого h2 и любых видов, ковалентно сшитых с h2. Самосшивание h2 не наблюдается при УФ-облучении (фиг. 7A, сравните дорожки 1 и 4). В отсутствие УФ-облучения на геле детектировалась только одна полоса, представляющая меченный Су5 h2. Однако после УФ-облучения на геле выше h2 появилась новая полоса (рис. 7A, дорожки 7 и 8). Кроме того, новая полоса зависит от модификации h4T6C APB, что указывает на то, что новая полоса является продуктом УФ-индуцированного перекрестного связывания между N-концевым хвостовым доменом h4 и h2 (Рисунок 7A, сравните дорожки 5, 6 и 7, 8). .Эти данные указывают на то, что N-концевой хвост h4 контактирует с h2 внутри мононуклеосомы.

Рисунок 7.

Доказательство того, что хвостовой домен h4 физически взаимодействует с CTD h2. ( A ) Хвостовой домен h4 сшивается с h2 в нуклеосомах. Меченный Cy5 h2 инкубировали с нуклеосомами, содержащими APB-модифицированный h4 T6C, сшивание инициировали УФ-светом, и продукты разделяли на гелях SDS-PAGE. Гели визуализировали с помощью флюорографии с обнаружением Cy5. Черная стрелка указывает положение несшитого h2, в то время как красная стрелка указывает положение предполагаемого сшивающего продукта h4 T6C-APB-h2.( B ) h2 разрушает специфические сайты сшивания ДНК хвоста h4 в нуклеосомах. Нуклеосомы, восстановленные с помощью h4 T6C-APB и 5′-конца радиоактивно меченной ДНК, подвергали облучению и визуализировали поперечные связи в виде разрывов цепей на 5% денатурирующих гелях ДНК (37). Дорожка 1, без облучения, дорожки 2–5, облученные образцы. Дорожки 1–3 содержат только нуклеосомы, а дорожки 4 и 5 содержат нуклеосомы, инкубированные с HMGN1 или h2, соответственно. Расположение диады нуклеосом указано открытой стрелкой. Цифры указывают сайты сшивок, не затронутые (черный) или затронутые (красный) связыванием h2.

Рисунок 7.

Для дальнейшего изучения взаимодействий хвоста h4 в нуклеосоме мы исследовали перекрестное связывание h4 T6C-APB с нуклеосомной ДНК в отсутствие и в присутствии h2. В предыдущей работе мы обнаружили, что APB-модифицированный h4 T6C сшивается с нуклеосомной ДНК в +82, +62, +23, –14, –56, –64 и –77 нуклеотида от диады (определяемой как позиция 0), образуя два кластера взаимодействия на поверхности нуклеосомной ДНК (37). Один кластер расположен внутри нуклеосомы (состоит из +62, +23, –14, –56 и –64), тогда как второй кластер расположен в линкерной области ДНК (состоит из +82 и –77).Наши текущие данные картирования перекрестных связей полностью согласуются с этими выводами (Рисунок 7B, сравните дорожки 1 и 3). В предыдущей работе также было обнаружено, что архитектурный фактор хроматина HMGN1 избирательно нарушает специфические взаимодействия хвоста h4-ДНК, что согласуется с текущими результатами (дорожка 4). Важно отметить, что мы обнаружили, что связывание h2 с нуклеосомой уменьшает сшивание на сайтах линкерной ДНК (-77, +82) и сайтах вблизи периферии ядра нуклеосомы (-56, -64), но не на более внутренних сайтах (Рисунок 7B, дорожка 5).Взятые вместе наши результаты перекрестного связывания предполагают, что связывание h2 перенаправляет взаимодействия конца хвостового домена h4 от линкерной ДНК, возможно, за счет прямого контакта с h2 CTD в нуклеосоме.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мы представляем доказательства новой связи между хвостовым доменом h4 и CTD h2. Наши данные показывают, что хвостовой домен h4 напрямую влияет на структуру CTD h2 и что специфические события ацетилирования в хвосте h4 изменяют структуру CTD h2.Мы обнаружили, что ацетилирование или модификации в других положениях в пределах хвоста h4 или других N-концевых хвостовых доменов внутри нуклеосомы не оказывают значительного влияния на структуру CTD. Наконец, мы предоставляем доказательства того, что хвост h4 напрямую взаимодействует с CTD h2, чтобы регулировать его структуру. Интересно, что ацетилирование в положениях K18, K23 и K27 N-концевого хвоста h4, но не в тех, которые расположены рядом с самым N-концом (K4, K9 и K14), приводит к снижению конденсации CTD h2, что указывает на то, что определенные события ацетилирования вызывают различные изменения конформации хвоста h4 в нуклеосомном контексте (48).Ацетилирование снимает положительный заряд с боковой цепи лизина. Было показано, что хвост h4 надежно взаимодействует как с нуклеосомной, так и с линкерной ДНК (37,48). Таким образом, большее количество внутренних ацетилирований вдоль хвоста h4 может приводить к измененной конформации, принимаемой связанным хвостом.

Наша предыдущая работа показывает, что изначально неупорядоченный CTD h2 подвергается значительной конденсации при связывании с нуклеосомами, что согласуется с принятием определенной структуры или ансамбля структур.Данные свидетельствуют о том, что энтропийные затраты, связанные с конденсацией CTD, по-видимому, компенсируются значительными положительными вкладами в общую свободную энергию связывания, происходящими от взаимодействия ~ 40 избыточных положительных зарядов внутри CTD с ДНК (25). В самом деле, CTD h2 важен для стабилизации структур хроматина более высокого порядка из-за нейтрализации заряда в линкерной ДНК, предполагая, что структура CTD h2 играет критическую роль в этой функции. Важно отметить, что структура CTD h2 связана по крайней мере с начальной стадией сворачивания массивов протяженных олигонуклеосом в структуры более высокого порядка (6), указывая на то, что склонность CTD h2 принимать различные конденсированные состояния, вероятно, влияет на стабильность укладки хроматина.Учитывая, что ацетилирование внутри h4-хвоста напрямую изменяет структуру h2 CTD, наша работа, следовательно, идентифицирует потенциально новый механизм, с помощью которого ацетилирование влияет на структуру хроматина более высокого порядка.

Несмотря на предполагаемую роль h2 как общего репрессора транскрипции, 50% -ное снижение экспрессии h2 в эмбриональных стволовых (ES) клетках мыши привело к незначительному количеству значительных изменений в экспрессии специфических генов (49). Однако было обнаружено, что h2 направляет эпигенетическую регуляцию импринтинговых генов h29 и Gtl2 посредством двух различных механизмов.Во-первых, h2 физически взаимодействует с ДНК-метилтрансферазой DNMT3B и DNMT1, способствуя установлению и поддержанию метилирования ДНК, которое приводит к репрессии генов в этих локусах; во-вторых, h2 может препятствовать связыванию SET7 / 9 и метилирования h4K4, модификации, связанной с активацией транскрипции (50). Следует отметить, что CTD-область h2 необходима для прямого взаимодействия между h2 и ДНК-метилтрансферазами. Кроме того, сообщалось, что прямое взаимодействие между h2 и гетерохроматин-специфичной h4 K9 метилтрансферазой Su (var) 3-9 является важным для репрессии мобильных элементов в гетерохроматине Drosophila (51).Важно отметить, что частичная или полная делеция h2 CTD приводит к сильной активации мобильных элементов, аналогичной той, что наблюдалась выше для нокдауна h2 (52). Такие взаимодействия могут зависеть от структуры CTD h2 и, таким образом, в свою очередь, могут регулироваться модификациями в пределах хвостового домена h4.

Мы ранее показали, что два члена семейства HMGN архитектурных факторов транскрипции, HMGN 1 и HMGN2, изменяют конденсацию CTD h2, не нарушая связывания глобулярного домена h2 в диаде нуклеосом (37).Более того, было показано, что фосфорилирование внутри пептидов, полученных из доменов h2 CTD, изменяет склонность к сворачиванию / конденсации в растворителях и солях, которые моделируют химическое окружение в хроматине (53), а также в природном хроматине (54,55). Принимая во внимание наши текущие открытия, эти данные предполагают, что h2 CTD может быть связующим звеном для передачи сигналов в нуклеосоме. В этом отношении понимание структуры h2 CTD и факторов, которые изменяют конечное состояние этого внутренне неупорядоченного домена в хроматине, будет критичным для расшифровки регуляции состояний хроматина.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Национальные институты здравоохранения [R01GM052426 — J.J.H., T32GM068411 — K.J.M.]; JSPS KAKENHI [JP18H05534 — H.K.]; Проект платформы для поддержки открытия лекарственных препаратов и исследований в области наук о жизни (BINDS) от AMED [JP20am0101076 — H.K.]; JST ERATO [JPMJER1901 — H.K.]; JST PRESTO [JPMJPR19K6 — G.H.]. Финансирование платы за открытый доступ: NIH [R01GM052426].

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

Luger

Mäder

A.W.

Ричмонд

R.K.

Сарджент

D.F.

Ричмонд

T.J.

Кристаллическая структура ядерной частицы нуклеосомы с разрешением 2,8 Å

Природа

1997

389

251

260

Резак

A.R.

Hayes

J.J.

Краткий обзор структуры нуклеосом

FEBS Lett.

2015

589

2914

2922

Syed

S.H.

Goutte-Gattat

Becker

Meyer

Shukla

M.S.

Hayes

J.J.

Everaers

Angelov

Bednar

Dimitrov

Картирование одноосновного разрешения h2-нуклеосомных взаимодействий и трехмерная организация взаимодействия нуклеосома

PNAS

2010

107

9620

9625

Беднар

Garcia-Saez

Boopathi

Резак

A.R.

Papai

Reymer

Syed

S.H.

Lone

I.N.

Тончев

О.

Распятие

Структура и динамика нуклеосомы 197∼bp в комплексе с линкерным гистоном h2

Мол. Ячейка

2017

384

397

Беднар

Horowitz

R.A.

Григорьев

S.A.

Carruthers

L.M.

Hansen

J.C.

Koster

A.J.

Вальдшнеп

C.L.

Нуклеосомы, линкерная ДНК и линкерный гистон образуют уникальный структурный мотив, который управляет сворачиванием и уплотнением хроматина более высокого порядка

Proc. Natl. Акад. Sci.США

1998

14173

14178

Клык

Wei

Lee

T.-H.

Hayes

J.J.

Структурно-зависимые конформации хроматина h2 CTD

Nucleic Acids Res.

2016

9131

9141

Гарсия-Саес

Menoni

Бупаты

р.

Шукла

М.С.

Soueidan

Noirclerc-Savoye

Le Roy

Skoufias

D.A.

Bednar

Hamiche

Структура h2-связанного 6-нуклеосомного массива обнаруживает конформацию раскрученного двухстартового хроматинового волокна

Мол. Ячейка

2018

902

915

Swygert

S.G.

Peterson

C.L.

Динамика хроматина: взаимодействие между ферментами ремоделирования и модификациями гистонов

Биохим. Биофиз. Acta (BBA) -Gene Regul. Мех.

2014

1839

728

736

Нарликар

Г.Дж.

Сундарамурти

р.

Owen-Hughes

Механизмы и функции АТФ-зависимых ферментов ремоделирования хроматина

Ячейка

2013

154

490

503

Allis

C.D.

Jenuwein

Молекулярные признаки эпигенетического контроля

Нац. Преподобный Жене.

2016

487

Торрес

I.O.

Fujimori

D.G.

Функциональная связь между записывающими, стирающими и считывающими метилирование гистонов и ДНК

Curr. Opin. Struct. Биол.

2015

Hammond

C.M.

Strømme

C.B.

Huang

Patel

D.J.

Groth

Гистоновые шаперонные сети, формирующие функцию хроматина

Нац. Rev. Mol. Cell Biol.

2017

141

Hebbes

T.R.

Торн

A.W.

Crane-Robinson

Прямая связь между ацетилированием корового гистона и транскрипционно активным хроматином

EMBO J.

1988

1395

1402

Ван

З.

Занг

С.

Розенфельд

J.A.

Schones

D.E.

Барски

Cuddapah

Cui

Roh

T.-Y.

Peng

Zhang

M.Q.

Комбинаторные паттерны ацетилирования и метилирования гистонов в геноме человека

Нац. Genet.

2008

897

Wong

Hattangadi

S.M.

Cheng

A.W.

Фрэмптон

G.M.

Янг

Р.А.

Lodish

H.F.

Индукция и репрессия генов во время терминального эритропоэза опосредуются отдельными эпигенетическими изменениями

Кровь

2011

118

e128

e138

Эберхартер

А.

Becker

P.B.

Ацетилирование гистонов: переключение между репрессивным и пермиссивным хроматином

EMBO Rep.

2002

224

229

Федоров

Д.В.

Чжоу

B.-R.

Skoultchi

A.I.

Bai

Новые роли линкерных гистонов в регуляции структуры и функции хроматина

Нац. Rev. Mol. Cell Biol.

2017

183

330

Carruthers

L.M.

Bednar

Woodcock

C.L.

Линкерные гистоны стабилизируют внутреннюю зависимую от соли укладку нуклеосомных массивов: механистические ответвления для сворачивания хроматина более высокого порядка

Биохимия

1998

14776

14787

Krishnakumar

Gamble

M.J.

Frizzell

K.M.

Berrocal

J.G.

Kininis

Kraus

W.L.

Взаимное связывание PARP-1 и гистона h2 на промоторах определяет результаты транскрипции

Наука

2008

319

819

821

Цао

К.

Lailler

Zhang

Kumar

Uppal

Liu

Lee E.

Lee

Medrzycki

Pan

Картирование с высоким разрешением вариантов гистонов линкера h2 в эмбриональных стволовых клетках

PLoS Genet.

2013

e1003417

Izzo

Kamieniarz-Gdula

Ramrez

Noureen

Kind

J. Manke

van Steensel

Schneider

Геномный ландшафт соматических линкерных подтипов гистонов от h2.1 до h2.5 в клетках человека

Cell Rep.

2013

2142

2154

Millan-Arino

Islam

A.B.M.M.K.

Искьердо-Боулдстридж

Mayor

Terme

Luque

Sancho

Lope

Jordan

Картирование шести вариантов гистона h2 соматического линкера в клетках рака молочной железы человека раскрывает специфические особенности h2.2

Nucleic Acids Res.

2014

4474

4493

Allan

Hartman

Crane-Robinson

Aviles

Структура гистона h2 и его расположение в хроматине

Природа

1980

288

675

679

Лю

Hamkalo

Parseghian

M.H.

Hansen

J.C.

Функции конденсации хроматина С-концевого домена линкерного гистона опосредуются специфическим аминокислотным составом и внутренним нарушением белка

Биохимия

2009

164

172

Катерино

T.L.

Клык

Hayes

J.J.

Нуклеосомный линкер ДНК контактирует и индуцирует специфическую укладку внутренне неупорядоченного карбоксиконцевого домена h2

Мол. Клетка. Биол.

2011

2341

2348

Harshman

S.W.

Янг

N.L.

Parthun

M.R.

Freitas

гистоны h2: современные перспективы и проблемы

Nucleic. Кислоты. Res.

2013

9593

9609

Hansen

J.C.

Ross

E.D.

Woody

R.W.

Внутреннее нарушение белков, аминокислотный состав и концевые домены гистонов

J. Biol. Chem.

2006

281

1853

1856

Кларк

Д.

Hill

Martin

Thomas

Альфа-спираль в карбоксиконцевых доменах гистонов h2 и H5

EMBO J.

1988

Roque

Iloro

Ponte

Arrondo

J.L.R.

Суау

П.

ДНК-индуцированная вторичная структура карбоксиконцевого домена гистона h2

J. Biol. Chem.

2005

280

32141

32147

Клык

Clark

D.J.

Hayes

J.J.

ДНК и нуклеосомы направляют отчетливую укладку линкерного С-концевого домена гистона h2

Nucleic Acids Res.

2012

1475

1484

Pepenella

Murphy

K.J.

Hayes

J.J.

Внутри- и межнуклеосомные взаимодействия основных гистоновых хвостовых доменов в структуре хроматина более высокого порядка

Хромосома

2014

123

Tse

Hansen

J.C.

Гибридные трипсинизированные нуклеосомные массивы: идентификация множественных функциональных ролей N-концов h3A / h3B и h4 / h5 в уплотнении хроматиновых волокон

Биохимия

1997

11381

11388

Dorigo

Schalch

Bystricky

Richmond

T.J.

Складывание хроматиновых волокон: требование для N-концевого хвоста гистона h5

J. Mol. Биол.

2003

327

Шогрен-Кнаак

М.

Ishii

Sun

J.M.

Pazin

M.J.

Davie

J.R.

Peterson

C.L.

Ацетилирование гистона h5-K16 контролирует структуру хроматина и белковые взаимодействия

Наука

2006

311

844

847

Кан

P.-Y.

Hansen

J.К.

Хейс

Дж. Дж.

Хвостовой домен h4 участвует во множественных взаимодействиях во время сворачивания и самоассоциации массивов нуклеосом

Мол. Клетка. Биол.

2007

2084

2091

Lehmann

Felekyan

Kühnemuth

Dimura

Tóth

l C.

SeideЯВЛЯЮСЬ.

Langowski

Динамика N-концевого хвоста нуклеосомного гистона h4, выявленная с помощью высокоточной одномолекулярной молекулы FRET

Nucleic Acids Res.

2020

1551

1571

Мерфи

К.Дж.

Резак

A.R.

Клык

Постников

Ю.В.

Bustin

Hayes

J.J.

HMGN1 и 2 ремоделируют основные и линкерные концевые домены гистонов в хроматине

Nucleic Acids Res.

2017

9917

9930

Ангелов

Vitolo

J.M.

Mutskov

Dimitrov

Hayes

J.J.

Предпочтительное взаимодействие основных хвостовых доменов гистонов с линкерной ДНК

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2001

6599

6604

Stutzer

Liokatis

Kiesel

Schwarzer

Sprangers

J. Селенко

Fischle

Модуляции контактов ДНК линкерными гистонами и посттрансляционные модификации определяют подвижность и модифицируемость нуклеосомных хвостов h4

Мол. Ячейка

2016

247

259

Pepenella

Murphy

K.J.

Hayes

J.J.

Отчетливое переключение во взаимодействиях хвостового домена гистона h5 при солевой укладке массивов нуклеосом

J. Biol. Chem.

2014

289

27342

27351

Хейс

Дж.J.

Lee

K.M.

Восстановление и анализ мононуклеосом in vitro, содержащих определенные ДНК и белки

Методы

1997

Хуан

Ю.С.

Chen

C.C.

Гао

Wang

Y.H.

Xiao

Wang

Tian

C.Л.

Ли

Ю.М.

Синтез l- и d-убиквитина путем лигирования в одном сосуде и безметалловой десульфуризации

Chem. Евро. J.

2016

7623

7628

Lowary

P.T.

Widom

Новые правила последовательности ДНК для связывания с высоким сродством с октамером гистонов и последовательного позиционирования нуклеосом

J. Mol. Биол.

1998

276

Majumdar

Z.K.

Hickerson

Noller

H.F.

Clegg

R.M.

Измерение изменений внутреннего расстояния 30S рибосомы с использованием FRET с несколькими донорно-акцепторными парами: методы количественной спектроскопии

J. Mol. Биол.

2005

351

1123

1145

Феррейра

Х.

Сомерс

Дж.

Webster

Flaus

Owen-Hughes

Гистоновые хвосты и спираль h4 ∼N регулируют подвижность и стабильность нуклеосом

Мол. Клетка. Биол.

2007

4037

4048

Tóth

Brun

Langowski

Траектория нуклеосомной линкерной ДНК изучалась с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии

Биохимия

2001

6921

6928

Кан

P.Y.

Катерино

T.L.

Hayes

J.J.

Хвостовой домен h5 участвует во внутри- и межнуклеосомных взаимодействиях с белком и ДНК во время сворачивания и олигомеризации массивов нуклеосом

Мол. Клетка. Биол.

2008

538

546

Моррисон

E.A.

Bowerman

Sylvers

K.L.

Wereszczynski

Musselman

C.A.

Конформация хвоста гистона h4 ингибирует ассоциацию пальца BPTF PHD с нуклеосомой

Элиф

2018

e31481

Вентилятор

Ю.

Никитина

Т.

Zhao

Fleury

T.J.

Bhattacharyya

Bouhassira

E.E.

Stein

Woodcock

C.L.

Skoultchi

A.I.

Истощение гистона h2 у млекопитающих изменяет глобальную структуру хроматина, но вызывает специфические изменения в регуляции генов

Ячейка

2005

123

1199

1212

Ян

С.М.

Kim

B.J.

Norwood Toro

Skoultchi

A.I.

Линкерный гистон h2 способствует эпигенетическому молчанию, регулируя как метилирование ДНК, так и метилирование гистона h4

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2013

110

1708

1713

Wontakal

S.N.

Kavi

Kim

B.J.

Guzzardo

P.M.

Емельянов

А.В.

Hannon

G.J.

Завадил

Дж.

Федоров

Д.В.

Drosophila h2 регулирует генетическую активность гетерохроматина путем привлечения Su (var) 3-9

Наука

2013

340

Кави

Х.

Емельянов

А.В.

Федоров

Д.В.

Skoultchi

A.I.

Независимые биологические и биохимические функции для отдельных структурных доменов дрозофилы линкерного гистона h2

J. Biol. Chem.

2016

291

15143

15155

Chaves-Arquero

Perez-Cañadillas

J.M.

Jimenez

M.A.

Влияние фосфорилирования на структурное поведение пептидов, происходящих из внутренне неупорядоченного С-концевого домена гистона h2. 0

Chem. Евро. J

2020

5970

5981

Raghuram

Strickfaden

McDonald

Williams

Fang

Mizzen

Hayes

J.J.

Thng

Hendzel

M.J.

Pin1 способствует дефосфорилированию гистона h2 и стабилизирует его связывание с хроматином

J. Cell Biol.

2013

203

Лопес

Р.

Сарг

Б.

Линднер

Х.

Бартоломе

С.

Ponte

Suau

Roque

Частичное фосфорилирование линкерного гистона: влияние на вторичную структуру и конденсацию хроматина

Nucleic Acids Res.

2015

4463

4476

задержаны пособники побега заключенных из ИВС в Подмосковье

НОВОСТИ ЧАСА

НСН

НСН

НСН

СК: задержаны пособники побега заключенных из ИВС в Подмосковье

Получайте свежие материалы на почту

Следите за новостями в социальных сетях

Получайте свежие материалы на почту

Завершено расследование уголовного дела в отношении бывших прокурорских работников из Новосибирска

В Калининградской области мужчина подозревается в покушении на убийство беременной жены и дочери

Емкостные характеристики монолитного электрода NaxV2O5 / CC толщиной 330 мкм за счет синергизма иерархической структуры пор и сверхмассивной нагрузки

Высокая экспрессия хемокинового рецептора 7 CC улучшает послеоперационный прогноз пациентов с аденокарциномой легких

Пациенты и образцы тканей

Выделение РНК и анализ ОТ-ПЦР

Иммуногистохимический анализ

Микродиссекция с лазерным захватом, выделение РНК и ОТ из срезов FFPE

Обнаружение области экспрессии CCR7 в срезах ткани путем окрашивания ИГХ

Статистический анализ

Сайтов-cubcadet-Site

Отсутствие хемокинового лиганда 2 CC не ограничивает инфильтрацию макрофагов в жировую ткань, связанную с ожирением

Abstract

РАЗРАБОТКА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Забор жировой ткани.

Выделение адипоцитов и стромальных сосудистых клеток из жировой ткани.

Определение уровней макрофагов в жировой ткани и выделение макрофагов из стромальных сосудистых клеток с помощью FACS.

ОТ-ПЦР на РНК жировой ткани, адипоцитов и стромальных сосудистых клеток.

Иммуногистохимия жировой ткани.

Измерения сыворотки и плазмы.

Статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Уровни CCL2 и CCL7 в сыворотке повышены у мышей дикого типа на диете с высоким содержанием жиров, но не обнаруживаются у мышей CCL2

CCL2

Отсутствие CCL2 не ограничивает инфильтрацию макрофагов в жировую ткань.

Отсутствие CCL2 не улучшает метаболическую функцию.

Отсутствие CCL2 не изменяет экспрессию мРНК маркера воспаления во всей жировой ткани.

Отсутствие CCL2 изменяет экспрессию воспалительного гена в клетках жировой ткани.

ОБСУЖДЕНИЕ

Благодарности

Сноски

ССЫЛКИ

Обзор, клиническая презентация, лабораторные исследования

Связь с модулированием ацетилирования между N-концевым доменом h4 и внутренне неупорядоченным C-концевым доменом h2 | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

ВВЕДЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспрессия и очистка линкерных гистонов и коровых гистонов

Нативное химическое лигирование ацетилированного пептида с гистоном h4

601 фрагменты ДНК для восстановления нуклеосом

Восстановление нуклеосом

Присоединение малеимида-Cy3 и малеимида-Cy5 к линкерному гистону

Анализ FRET

Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA)

сшивание h4

РЕЗУЛЬТАТЫ

Делеция N-концевого хвостового домена h4 изменяет конденсацию CTD h2

Имитаторы ацетилирования N-хвоста h4 уменьшают конденсацию CTD h2

Модификация N-концевого хвоста h4 не влияет на конденсацию h2 CTD за счет изменения траектории линкерной ДНК

Глютамин эффективно моделирует ацетилированный лизин

Обнаружение взаимодействия между N-концевым хвостовым доменом h4 и h2 в нуклеосоме

ОБСУЖДЕНИЕ

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

ФИНАНСИРОВАНИЕ

ССЫЛКИ

Добавить комментарий Отменить ответ